Restriction-modification
Restriction-modification (RM)-system finns överallt i det prokaryotiska riket där de fungerar som försvarssystem mot främmande DNA. För närvarande är 47 system av typ I, 3320 system av typ II och åtta system av typ III kända. R. Roberts (Beverly, MA) påpekade att restriktionsenzymer fram till nyligen hade identifierats genom att man hade fått bakterier från kultursamlingar och miljöprover och analyserat dem med avseende på restriktionsaktivitet. Nu är det möjligt att screena nya DNA-sekvenser för DNA-metyltransferasgener (MTase), som kan identifieras genom sina bevarade motiv, och sedan leta efter associerade gener. Dessa är bra kandidater för restriktionsendonukleasgener, eftersom generna för DNA-metyltransferaser och restriktionsendonukleaser ofta är kopplade till varandra. I de senaste genomprojekten har man på detta sätt identifierat ett oväntat stort antal förmodade RM-system. Till exempel identifierades 25 olika MTasgener i Helicobacter pyloris genom, och några av dessa var associerade med restriktionsenzymgener. Screening av databaser kan därför bli en mycket produktiv metod för att hitta restriktionsenzymer med nya specificiteter. A. Piekarowicz (Warszawa, Polen) rapporterade om ett exempel på ett sådant tillvägagångssätt som ledde till identifiering av ett nytt restriktionsenzym av typ IC, NgoAXVI.
Restriktionsenzymer av typ I och typ III, liksom det metylberoende McrBC-enzymet, kräver två igenkänningsställen och är beroende av ATP-hydrolys (McrBC: GTP) för DNA-klyvning (recenserad i Rao et al., 2000). Klyvning sker när två sådana enzymer kolliderar när de translokerar DNA, vilket förklarar kravet på två platser (Figur (Figur2).2). T. Bickle (Basel, Schweiz) visade att typ I-enzymer och McrBC också kan stimuleras att klyva DNA när de stöter på en ospecifik blockering. Typ III-enzymer hämmas däremot av sådana blockeringar, eftersom varje translokaliserande enzym klyver endast en sträng och kräver samarbete med ett annat enzym för att klyva båda DNA-strängarna.
Fig. 2. Modell för aktivering av restriktionsenzymer som kräver ATP (eller GTP) för DNA-klyvning. Efter bindning av två enzymmolekyler (eller komplex) till två igenkänningsställen på en linjär DNA-molekyl translokeras DNA:t i en aktiv, energiberoende process som kräver ATP eller GTP, beroende på system. På så sätt blir DNA:t utspärrat. Klyvningen sker efter kollision av två translokaliserande komplex, på slumpmässiga platser i närheten av igenkänningsställena (typ III-enzymer och McrBC) eller längre bort från dem (typ I-enzymer).
Och även om de flesta typ II-restriktionsenzymer är homodimerer som interagerar med en kopia av deras palindroma igenkänningsställe, så finns det subtyper som kräver samarbete mellan två ställen (granskad i Pingoud och Jeltsch, 1997). Som S. Halford (Bristol, UK) påpekade är detta inte bara fallet för typ IIe-enzymer, som NaeI, utan även för typ IIf-enzymer, som SfiI, och typ IIS-enzymer, som FokI. Typ IIf-enzymer är homotetramer med två separata DNA-bindningsställen, var och en bildad av två subenheter. SfiI är endast aktiv när båda DNA-bindningsställena är upptagna, vilket leder till en samtidig klyvning av båda ställena. För FokI, som består av en klyvnings- och en igenkänningsdomän, har det tidigare visats att dimerisering av enzymet på DNA krävs för att klyvning ska ske. Halford har nu visat att det krävs två igenkänningsställen för effektiv klyvning, eftersom var och en av igenkänningsdomänerna måste interagera med en igenkänningssekvens. Alla tre typerna av enzymer fungerar optimalt med två platser på samma DNA, där de fångar DNA:t mellan platserna i en slinga.
Attypiska restriktionsenzymer av typ II fortsätter att upptäckas. BbvCI är ett heterodimeriskt restriktionsenzym som känner igen en asymmetrisk sekvens. Underenheterna är inaktiva var för sig, men aktiva tillsammans. Detta gör det möjligt att skapa specifika nikkingenzymer genom att inaktivera en subenhet med hjälp av platsstyrd mutagenes, vilket rapporterades av G. Wilson (Beverly, MA). A. Janulaitis (Vilnius, Litauen) fick ett liknande resultat för det heterodimera restriktionsenzymet Bpu10I. Han lyckades också lätta på substratspecificiteten hos Eco57I, ett monomeriskt restriktions- och modifieringsenzym, som har en enda måligenkänningsdomän. I den här studien användes slumpmässig mutagenes för att generera en variant som interagerar inte bara med den kanoniska CTGAAG-platsen utan även med CTGGAG-platser. Den molekylära grunden för denna avslappnade specificitet har ännu inte fastställts. V. Siksnys (Vilnius, Litauen) rapporterade om upptäckten av ett nytt restriktionsenzym av typ IIs, BfiI, som inte är beroende av divalenta metalljoner för klyvning. Detta enzym visar sekvenslikhet med ett ospecifikt nukleas från Salmonella typhimurium och använder förmodligen en liknande katalytisk mekanism.
A. Pingoud (Giessen, Tyskland) diskuterade mekanismen för DNA-klyvning av restriktionsenzymer av typ II och homing endonucleases, som har en gemensam funktion, men som i allmänhet har olika strukturer och förmodligen följer olika mekanismer för klyvning. Trots att detaljerad strukturinformation finns tillgänglig för många restriktionsenzymer som har ett gemensamt katalytiskt motiv finns det ingen konsensus om den katalytiska mekanismen eller antalet Mg2+-joner som är inblandade i katalysen. I princip gäller samma sak för andra fosforyltransferaser med ett restriktionsenzymliknande katalytiskt centrum. Exempel på sådana proteiner är Vsr-reparationsenzym (E. coli) och Hjc-resolvas (Pyrococcus furiosus). Kristallstrukturen för det sistnämnda presenterades av K. Morikawa (Osaka, Japan) (figur (figur3).3). Däremot verkar mekanismen för DNA-klyvning av de homing endonukleaserna i HNH-familjen, t.ex. I-PpoI, vara bättre etablerad, eftersom strukturell information finns tillgänglig för det fria enzymet samt för enzym-substrat- och enzym-produktkomplex, förutom detaljerad biokemisk information för detta och besläktade enzymer i ”ββα-Me finger”-överfamiljen. Dessa enzymer kräver en Mg2+-jon som kofaktor som är bunden till en konserverad Asn. Den attackerande hydroxyljonen genereras av en bevarad His, stabilisering av övergångstillstånd involverar en bevarad Arg och protonering av avgångsgruppen möjliggörs av en vattenmolekyl från Mg2+-jonens hydreringssfär.
Fig. 3. Jämförelse av restriktionsendonukleasveckorna hos Hjc och Vsr som ett exempel på bevarande av strukturer för enzymer med besläktade funktioner. Ribbdiagrammen för Hjc och Vsr visas i samma orientering efter överlagring av de två strukturerna. Sidokedjorna för de aktiva platsresterna är markerade och de två bevarade Asp-resterna är märkta. Denna figur har vänligen tillhandahållits av T. Nishino och K. Morikawa.
Bakterier har utvecklat RM-system för att bekämpa bakteriofager. Dessa har i sin tur utvecklat olika sätt att undkomma begränsning av bakteriella RM-system. D. Dryden (Edinburgh, Storbritannien) rapporterade resultaten av en biokemisk analys av genen 0.3-protein från bakteriofag T7, som är en hämmare av restriktionsmodifieringsenzymer av typ I. Detta protein binder stökiometriskt till restriktionsenzymet och på grund av sin förlängda form och negativa ytladdning fyller det förmodligen helt enzymets DNA-bindningsställe och förhindrar därmed DNA-bindning.
RM-system består av restriktionsendonukleaser och DNA-metyltransferaser (MTaser) (granskad i Cheng, 1995; Robertson och Wolffe, 2000). Eftersom DNA-metyleringsmönstret tillför information till DNA:t och därmed utökar dess kodningskapacitet, är MTaser emellertid inte bara restriktionsenzymernas följeslagare i RM-system, utan har många andra viktiga funktioner. I prokaryoter spelar de roller i DNA-reparation och reglering av genuttryck och DNA-replikation. I eukaryoter leder DNA-metylering i allmänhet till transkriptionell tystnad av gener. Den bidrar till epigenetiska processer som t.ex. inaktivering av X-kromosomen, prägling och genreglering. I och med upptäckten att flera DNA MTaser är viktiga för utvecklingen hos möss har betydelsen av DNA-metylering blivit allmänt accepterad.
X. Cheng (Atlanta, GA) presenterade strukturen av Dnmt2-proteinet, som kan vara den första strukturen av ett eukaryotiskt DNA MTas. Proteinet har ett MTasveck och besitter alla de karakteristiska katalytiska motiven, men verkar sakna katalytisk aktivitet. Detta väcker frågor som huruvida det verkligen är ett enzym och vad dess substrat egentligen är (DNA, RNA eller något annat). Ytterligare diskussioner om eukaryota enzymer av Cheng och A. Jeltsch (Giessen, Tyskland) handlade om enzymerna Dnmt1, Dnmt3a och Dnmt3b. Båda talarna rapporterade resultat som erhållits med trunkerade proteiner och isolerade domäner av dessa enorma enzymer (som omfattar upp till 1 700 aminosyrarester), samt presenterade resultat som rörde den enzymatiska analysen av renade enzymer. Eftersom Dnmt1:s katalytiska domän (∼500 aminosyrarester) inte är aktiv i isolerad form måste den stå under noggrann kontroll av andra delar av enzymet. Denna interaktion kan vara nödvändig för att säkerställa en hög specificitet för hemimetylerat DNA. Trots framstegen på området är DNA-metyleringsprocessen hos eukaryoter, särskilt de mekanismer som skapar DNA-metyleringsmönstret, fortfarande dåligt förstådd.
Det finns något mer kunskap om DNA-metylering hos prokaryoter. R. Gumport (Urbana, IL) presenterade strukturen av det prokaryotiska MTaset M.RsrI, vilket bekräftar förmodan att de katalytiska domänerna hos alla MTaser har en gemensam arkitektur. S. Klimasauskas (Vilnius, Litauen), D.N. Rao (Bangalore, Indien), Gumport och Jeltsch diskuterade den molekylära enzymologin hos fyra prokaryotiska MTaser (M.HhaI, M.EcoP15, M.RsrI och M.EcoRV). Den katalytiska cykeln för dessa enzymer innefattar DNA- och kofaktorbindning, lokalisering och identifiering av målplatsen samt konformationsförändringar i komplexet, inklusive basflipning och överföring av metylgrupper (figur (figur4).4). Skillnader i detaljerna blev uppenbara; t.ex. ordningen för substrat- och kofaktorbindning och det hastighetsbegränsande steget skiljer sig åt i olika MTaser. 2-aminopurin visade sig vara ett bra verktyg för att analysera kinetiken för de konformationsförändringar som DNA genomgår i komplex med MTaser, inklusive basflimmer.
Fig. 4. Mekanism för lokalisering av målplatsen genom restriktionsendonukleaser och DNA-metyltransferaser. Först binds DNA ospecifikt, sedan lokaliseras målplatsen genom underlättad diffusion (glidning och hoppning) på DNA. Kontakter med målpunkterna leder till konformationsförändringar hos enzymet och DNA:t som i sin tur utlöser katalysen. Denna mekanism är gemensam för de flesta enzymer som specifikt interagerar med DNA.