Translation är en process som innebär att en aminosyrakedja syntetiseras från en mRNA-blueprint. Dessa polypeptidkedjor viks till funktionella proteiner. Translation sker utanför kärnan när den nukleära bearbetningen av pre-mRNA är klar och mRNA-molekylerna har transporterats till cytoplasman via kärnporer. Translation underlättas främst av ribosomer som finns på det grova endoplasmatiska retikulumet, på kärnhöljets yttre yta eller i cytoplasman.
- Initiering
- Förlängning
- Terminering
- Rekylering
Ett antal molekylära komponenter spelar en roll i översättningen, varav den mest framträdande är ribosomen. Detta makromolekylära komplex består av flera proteiner och rRNA-molekyler. Alla ribosomer har en liten och en stor underenhet, men sammansättningen av dessa underenheter skiljer sig avsevärt mellan olika arter. Hos människan består till exempel den lilla 40S-underenheten av 33 proteiner och en enda 18S-rRNA-molekyl medan den stora 60S-underenheten består av 47 proteiner och tre rRNA (5S, 5,8S och 28S) .
Trots identifieringen av 80 proteiner som är associerade med människans ribosom finns endast 34 i andra eukaryoter eller prokaryoter . Medan allmänna funktioner har föreslagits för ribosomassocierade proteiner, såsom stabilisering av komplexet och reglering av translation, har vissa också tillskrivits co-translationell modifiering av nysyntetiserade proteiner (granskad i ).
Elongation
I motsats till initierings-, terminerings- och ribosomåtervinningsstegen i translation är mekanismerna som driver elongationen i hög grad konserverade mellan eukaryoter och bakterier (granskad i ).
Kodonigenkänning
Elongeringen sker i flera väldefinierade steg, som börjar med att mRNA-kodonerna erkänns av motsvarande aminoacyl-tRNA. Föreningen med mRNA sker via den ribosomala A-platsen och påverkas av olika förlängningsfaktorer. GTPaset eEF1A levererar t.ex. aminoacyl-tRNA till A-platsen efter att ha aktiverats av eEF1B, en guaninnukleotidutbytesfaktor (GEF) som påskyndar dissocieringen av GDP från eEF1A .
Peptidbindningsbildning
Efter erkännande av mRNA-kodonet skapas en peptidbindning mellan aminoacyl-tRNA:t och peptidyl-tRNA:t (som befinner sig i den ribosomala P-platsen). Denna reaktion underlättas av peptidyltransferas, som i sig inte är ett protein utan ett mycket konserverat ribosomalt RNA . Mekanismen för bildandet av peptidbindningar inbegriper konformationsförändringar på den aktiva platsen snarare än kemisk katalys av ribosomala grupper och drivs av gynnsamma entropiförändringar .
Translokation av mRNA och tRNA genom ribosomen
När peptidbindningen har bildats blir A-sidan ledig när det peptidyl-tRNA som upptar den flyttas till P-sidan i den stora ribosomala underenheten, och samtidigt ersätter ett befintligt deacylerat tRNA som flyttas till E-sidan innan det lämnar ribosomen . När aminosyrakedjan växer och A- och P-platserna tillfälligt upptas av nya aminoacyl- respektive peptidyl-tRNA, sker en translokation av mRNA genom ribosomen.
Två mekanismer, som kännetecknas av konformationsförändringar i de ribosomala underenheterna, underlättar mRNA- och tRNA-translokation. Dessa är kända som ”ratcheting” och ”swiveling”.
Ratcheting observeras i alla translationsstadier och innebär att den lilla ribosomala underenheten genomgår en liten rotation, på cirka ~8° i förhållande till den stora underenheten (granskad i ). Detta skiljer sig från swiveling som innebär en rörelse av den lilla underenhetens huvuddomän (30S). Viktigt är att svängningen spelar en roll för ribosomens inneboende helikasaktivitet, som är viktig för avveckling av sekundära mRNA-strukturer .
Dessa mekanismer säkerställer i slutändan att tRNA rör sig på ett sekventiellt sätt (A-sida till P-sida till E-sida) och möjliggör bildandet av de mellanliggande tillstånd som man vet existerar under mRNA-tRNA-translokation. Dessa tillstånd, som också kallas hybridtillstånd , kan beskrivas med den eukaryota modellen som exempel. Här rör sig tRNA:s 3′-ändar som upptar A- och P-platserna till P- och E-platserna i 60S-underenheten, medan 5′-ändarna, som är förknippade med mRNA:t, förblir förankrade till A- respektive P-platserna i 40S-underenheten .
Dessa hybridtillstånd stabiliseras tillfälligt genom att eEF2-GTP (EF-G – GTP hos prokaryoter) binds till den ribosomala A-platsen. Hydrolys av GTP, som dock förmedlas genom GTPase-aktiviteten hos EF-G eller eukaryotisk homolog eEF2, gör det möjligt för ratcheting-mekanismen att fortsätta och får mRNA och tRNA:s 5′-ändar att förflytta sig från A- och P-platserna till P- respektive E-platserna. När den kanoniska A/A, P/P, E/E-konformationen (60S/40S) väl är återställd, dissocieras EF-G – GDP från ribosomen och lämnar A-platsen öppen för att ta emot en ny aminoacyl-tRNA-molekyl .
GTP-hydrolys av EF-G / eEF2, och den efterföljande svängningen av huvuddomänen hjälper ytterligare till med tRNA-translokationen genom att förhindra varje spontan bakåtriktad rörelse av tRNA .
Initiering av översättning
Det första steget i översättningen är känt som initiering. Här samlas de stora (60S) och små (40S) ribosomala enheterna till en fullt fungerande 80S ribosom. Denna placeras vid startkoden (AUG) i den mRNA-sträng som ska översättas (granskad i ).
Initiering anses vara det hastighetsbegränsande steget i den övergripande processen och regleras och samordnas främst av en grupp proteiner som kallas eukaryota initieringsfaktorer (eIFs) . Dessa faktorer varierar i storlek och komplexitet, från den enda 113 kDa eIF1-underenheten till 700 kDa eIF3-komplexet. Hos människan fungerar minst 12 eIF:er i samverkan för att reglera initieringen, och var och en av dem spelar en särskild roll, som har granskats ingående i .
Initiationen börjar med bildandet av ett ternärt komplex som består av eIF2, GTP och initiatorns tRNA (Met-tRNAi). Det ternära komplexets primära roll är att leverera initiatorn till 40S-underenheten som därefter bildar ett 43S-komplex, även kallat PIC (pre-initiationskomplex). Med hjälp av eIF4G och eIF3 binder PIC till mRNA:s 5′-terminus eller nära den. Detta markeras av en 7-metylguanosin-kapsel (m7-G-cap). När PIC har bundits söker PIC av den 5′ otranslaterade regionen för att lokalisera initieringskoden.
Ledarsekvensen i 5′-terminus upprätthålls i ett avvecklat tillstånd av helikasaktiviteten hos flera eIFs (inklusive eIF4F, eIF4G, eIF4A, eIF4B, eIF3). När 40S-underenheten väl är placerad vid initieringskoden rekryteras 60S-underenheten för att bilda en förlängningskompetent 80S-ribosom. Vid denna tidpunkt är mRNA:s startkodon lokaliserat i den ribosomala P-platsen, och hela initieringskomplexet är redo att gå in i förlängningsfasen .
Det är viktigt att notera att 40S-underenheten kan binda till mRNA oberoende av m7-G-cap. Det mest framträdande exemplet på detta, som tros förekomma i 5-10 % av cellulära mRNA, innebär att 40S-underenheten binder till en IRES (internal ribosome entry site) . Andra m7-G-cap-oberoende initieringsvägar inkluderar shunting , tethering , translation enhancers , ett TISU-element och en polyadenylatledare i 5′-terminus .
Ribosomåtervinning
Det sista steget i översättningen är ribosomåtervinning, vilket innebär att ribosomen delas upp i sina mindre underenheter och förbereder sig för en ny översättningsomgång. Hos eukaryoter innebär detta att 80S-ribosomen delas upp i sina 40S- och 60S-underenheter. Även om detta steg markerar att översättningsprocessen är avslutad kan det också inträffa av en rad andra skäl, bland annat när syntesen av polypeptidkedjan misslyckas, när skadat mRNA påträffas eller efter sammansättning av tomma ribosomer. Dessutom beskrivs detta steg ofta som början på initieringen, där det nyckelprotein som underlättar ribosomdelning också associeras med flera initieringsfaktorer (ABCE1 har visat sig associera med eIF2, eIF3 och eIF5 i jästmodeller ).
I eukaryoter underlättas ribosomåtervinningen främst av ABCE1 (Rli1 i jäst), som tillhör ABC-superfamiljen av ATPaser. Detta protein, som har två nukleotidbindningsdomäner och en unik FeS1-klusterdomän, binder till post-termineringskomplexet när RF3-GDP har dissocierats från ribosomen. Denna förening bildas genom interaktion mellan FeS-klustret och eRF1. Det är viktigt att ACBE1 också innehåller många bindningsställen som möjliggör interaktioner mellan ribosomala underenheter och olika ribosomala proteiner. Till exempel har ett HLH-motiv i den första nukleotidbindningsdomänen visat sig binda till 18S rRNA samt rpS24-A . Även om den exakta mekanismen som driver ribosomal delning fortfarande är oklar, föreslås det att den i eukaryoter är resultatet av en konformationsförändring i ABCE1 som induceras av ATP-hydrolys.
Som tidigare nämnts är peptidfrisättning inte en förutsättning för dissociation av ribosomala underenheter eller för ABCE1-bindning . Detta är viktigt när ribosomåtervinning induceras som svar på mRNA-skada eller sammansättning av lediga ribosomer, eftersom ingen stop-codon kommer att upptäckas för att initiera terminering och peptidfrisättning. För att övervinna detta kan ABCE1 underlätta peptidfrisättning på ett liknande sätt som det ternära komplexet eRF1-eRF3-GTP, och detta har visat sig ske oberoende av ATP-hydrolys. Här inducerar ATP-hydrolys en konformationsförändring i eRF1 som främjar peptidyl-tRNA-hydrolys.
Viktigt nog kan eRF1 och eRF3 vara tillräckliga för att initiera dissociation av underenheter, men detta kommer att ske i en långsammare takt.
Mekanismerna för återvinning i prokaryoter skiljer sig från dem i eukaryoter, där den viktigaste skillnaden är närvaron av en specialiserad ribosomåtervinningsfaktor (RRF) som agerar tillsammans med EF-G för att separera de ribosomala subenheterna i bakterier .
Översättningens avslutande
Nästkommande steg i översättningsprocessen är avslutandet. I detta steg anger en mRNA-stoppkodon att inga ytterligare aminosyror ska läggas till det växande proteinet. Terminering i eukaryoter underlättas av endast två faktorer (eRF1 och eRF3) och skiljer sig avsevärt från processen i prokaryoter, som involverar tre faktorer (RF1, RF2 och RF3) . I eukaryoter måste två olika processer äga rum för att peptidförlängningen ska kunna avslutas på ett framgångsrikt sätt, nämligen peptidfrisättning och bildandet av post-termineringskomplexet. I vissa fall, när översättningen måste avslutas innan ett stoppkodon upptäcks, kan avslutningssteget hoppa över och ribosomåtervinningen påbörjas tidigt. I detta fall underlättas peptidfrisättningen av ABCE1.
Termineringen utlöses av att ett stoppkodon (UAA, UGA eller UAG) registreras i den ribosomala A-sidan. Detta kodon känns igen av en frisättningsfaktor av klass 1 (RF1). I eukaryoter binder denna faktor (eRF1) till ribosomen som en del av ett förmonterat ternärt komplex bestående av eRF1, eRF3 och GTP . Stoppkodonen känns igen av ett konserverat motiv som finns i proteinets aminoterminala ände, t.ex. NIKS-motivet .
eRF1 hjälper också till med peptidyl-tRNA-hydrolys och peptidfrisättning från peptidyltransferascentret (PTC). Detta sker till följd av GTP-hydrolys av eRF3, vilket inducerar en konformationsförändring i eRF1 som gör det möjligt för dess Gly-Gly-Gln-motiv (GGQ), som är beläget i den ”mellersta” (M) domänen, att komma in i det ribosomala PTC och underlätta peptidyl-tRNA-hydrolys. Denna mekanism skiljer sig från den hos prokaryoter, där peptidfrisättning krävs för, och därmed föregår, GTP-hydrolys av RF3 .
Efter GTP-hydrolys och peptidfrisättning dissocieras RF3-GDP från proteinet och lämnar kvar RF1, som förblir bundet till ribosomen i det så kallade post-termineringskomplexet . Detta förbereder i huvudsak ribosomen för ribosomal återvinning.