Fluorescence je jedním z nejdůležitějších a nejužitečnějších nástrojů v sadě nástrojů biologa. V biologii se téměř v každém oboru, od fyziologie po imunologii, používají fluorescenční molekuly (tzv. fluorofory) k detekci bílkovin. Konkrétní vědecké poznatky o tom, jak fluorescence funguje, však mohou být matoucí nebo přehlížené.
Nebojte se! V tomto článku rozebereme klíčové body fluorescence, abyste se mohli stát odborníkem, jakým jste vždy chtěli být.
Co přesně JE fluorescence?
Podle definice je fluorescence typem fotoluminiscence, což se děje, když je molekula excitována fotony ultrafialového nebo viditelného světla. Přesněji řečeno, fluorescence je výsledkem toho, že molekula absorbuje světlo o určité vlnové délce a vyzařuje světlo o delší vlnové délce.
Podrobnosti, prosím
Naštěstí tomuto tématu zasvětil svůj život Dr. Aleksander Jablonski. Nakonec vytvořil Jablonského diagram, který popisuje absorpci a emisi světla. Stručně řečeno, 3 kroky fluorescence jsou absorpce (neboli excitace), nezářivý přechod (neboli doba života v excitovaném stavu) a emise fluorescence.1
Obrázek 1. Jablonského diagram. S0 a S1 představují různé elektronické stavy. Ostatní čísla (zde 0-3) představují vibrační stavy. S laskavým svolením Jacobkhed.
Krok 1: Excitace
Zpět k obecné chemii: Viditelné světlo existuje jako elementární částice nazývané fotony. Tyto částice jsou základní balíčky energie, které po absorpci pohánějí nebo „excitují“ molekulu pohlcující světlo na vyšší energetickou hladinu. V případě fluorescence absorbují fluorofory viditelné světlo, obvykle poskytované žárovkou nebo laserem, což vede k excitovanému elektronickému singletovému stavu (S1) molekuly.
Krok 2: Životnost excitovaného stavu
Jak všichni víme, cílem atomu je být v co nejnižším energetickém stavu. Když je tedy fluorofor excitován do vyššího elektronického stavu, chce okamžitě začít uvolňovat energii; proto tento excitovaný stav, známý jako doba života excitovaného stavu, netrvá příliš dlouho (obvykle 1-10 nanosekund). Přesto je tento krok procesu nesmírně důležitý, protože během něj se energie z S1 začne rozpadat směrem k „uvolněnému“ singletovému excitovanému stavu, z něhož vzniká fluorescenční emise.
Krok 3: Emise
A konečně jsme připraveni na fluorescenci! Počínaje „uvolněným“ excitovaným stavem se vysokoenergetický foton rychle rozpadá směrem k základnímu stavu a tuto přebytečnou energii emituje jako foton světla. Tento přechod energie známe jako fluorescenci. Zajímavé je, že protože část této energie byla uvolněna již během života v excitovaném stavu, je energie nyní fluoreskujícího fotonu nižší než energie excitačního fotonu. Energie uvolněná během fluorescence tak bude mít vždy delší vlnovou délku, než jaká je potřebná pro excitaci.
Jak využívá průtoková cytometrie fluorescenční molekuly?
Koncepci a základům průtokové cytometrie jsme se věnovali v předchozích článcích a webináři, takže pokud potřebujete, vraťte se a osvěžte si téma.
Jste připraveni? Jdeme na to!
Při práci s fluorescenčními molekulami musíme věnovat zvláštní pozornost rozdílu mezi excitační a emisní vlnovou délkou nebo energií, jinak známému jako Stokesův posun. Význam Stokesova posunu spočívá v jeho jednoduchosti: umožňuje nám určit, zda je vlnová délka emitovaného světla a vlnová délka excitačního světla dostatečně velká, abychom je mohli spolehlivě rozlišit. Vzhledem k tomu, že odečet průtokové cytometrie je založen výhradně na fluorescenci, je nezbytné tento parametr znát, jinak riskujeme, že budeme generovat nespolehlivá, poop emoji data.
Mimo to je nesmírně důležité sledovat absorpční a emisní spektrum pro každý fluorofor a to, jak mohou různé lasery s daným fluoroforem interagovat. Například v přístroji pro průtokovou cytometrii vyzařuje argonový iontový laser světlo o vlnové délce 488 nm, které excituje fluorofor, fluorescein isothiokyanát (FITC). Protože 488 nm je velmi blízko absorpčního maxima FITC, vede excitace k vysoké emisi FITC. Pokud je však FITC excitován jinou vlnovou délkou jiného laseru v rámci svého absorpčního spektra, emituje světlo ve stejném spektru, ale nemá stejnou intenzitu.
A to je vše: stručný úvod/připomenutí fluorescence a jejího vztahu k fluorescenčním molekulám využívaným v průtokové cytometrii. Máte otázky? Připomínky? Dejte nám vědět!