Fluorescens er et af de vigtigste og mest nyttige værktøjer i en biologs værktøjskasse. Inden for biologien bruger næsten alle områder, fra fysiologi til immunologi, fluorescerende molekyler (også kaldet fluorophorer) til at påvise proteiner. Men den specifikke videnskab bag, hvordan fluorescens fungerer, kan være forvirrende eller overset.
Dygt ikke! I denne artikel opdeler vi de vigtigste punkter om fluorescens, så du kan blive den ekspert, du altid har ønsket at være.
Hvad er fluorescens helt præcist?
På definition er fluorescens en type fotoluminescens, hvilket er det, der sker, når et molekyle bliver exciteret af ultraviolette eller synlige lysfotoner. Mere specifikt er fluorescens resultatet af, at et molekyle absorberer lys ved en bestemt bølgelængde og udsender lys ved en længere bølgelængde.
Detaljer, tak
Det er heldigvis dette emne, som Dr. Aleksander Jablonski har viet sit liv til. Han udviklede til sidst Jablonski-diagrammet til at beskrive absorption og emission af lys. Kort sagt er de 3 trin i fluorescens absorption (eller excitation), ikke-radiativ overgang (eller exciteret tilstandens levetid) og fluorescensemission.1
Figur 1. Jablonski-diagram. S0 og S1 repræsenterer forskellige elektroniske tilstande. De øvrige tal (her 0-3) repræsenterer vibrationstilstande. Med venlig hilsen af Jacobkhed.
Strin 1: Excitation
Flashback til almen kemi: Synligt lys eksisterer som elementarpartikler kaldet fotoner. Disse partikler er essentielle energipakker, der, når de absorberes, vil drive eller “excitere” det lysabsorberende molekyle op på et højere energiniveau. I tilfælde af fluorescens absorberer fluorophorer synligt lys, der normalt kommer fra en glødelampe eller laser, hvilket fører til en exciteret elektronisk singlettilstand (S1) i molekylet.
Stræk 2: Livstid i exciteret tilstand
Som vi alle ved, er målet for et atom at være i den laveste energitilstand som muligt. Så når en fluorofore bliver exciteret til en højere elektronisk tilstand, ønsker den straks at begynde at frigive energi; derfor varer denne exciterede tilstand, kendt som exciteret-tilstandslevetiden, ikke særlig længe (typisk 1-10 nanosekunder). Alligevel er dette trin i processen utrolig vigtigt, da det er i løbet af denne tid, at energien fra S1 begynder at aftage mod en “afslappet” singlet exciteret tilstand, hvorfra fluorescensemissionen stammer.
Strin 3: Emission
Og endelig er vi klar til noget fluorescens! Med udgangspunkt i den “afslappede” exciterede tilstand henfalder fotonen med høj energi hurtigt til grundtilstanden og udsender denne overskydende energi som en foton af lys. Denne energiovergang er det, vi kender som fluorescens. Det interessante er, at fordi noget af energien allerede blev frigivet i løbet af den exciterede tilstands levetid, er energien af den nu fluorescerende foton lavere end energien af excitationsfotonen. Derfor vil den energi, der frigives under fluorescens, altid have en længere bølgelængde end den, der er nødvendig for excitationen.
Hvordan udnytter flowcytometri fluorescerende molekyler?
Vi har dækket begrebet og det grundlæggende i flowcytometri i tidligere artikler og et webinar, så gå tilbage og genopfrisk emnet, hvis du har brug for det.
Er du klar? Lad os komme i gang!
Når vi har med fluorescerende molekyler at gøre, skal vi være særligt opmærksomme på forskellen mellem excitations- og emissionsbølgelængderne eller energien, også kendt som Stokes-skiftet. Betydningen af Stokes-skiftet ligger i dets enkelhed: det giver os mulighed for at afgøre, om bølgelængden af det udsendte lys og bølgelængden af excitationslyset er stor nok til, at vi pålideligt kan skelne dem fra hinanden. Da aflæsningen af flowcytometri udelukkende er baseret på fluorescens, er det vigtigt at være opmærksom på denne parameter, ellers risikerer man at generere upålidelige, poop emoji-data.
Det er desuden ekstremt vigtigt at holde styr på absorptionsspektret og emissionsspektret for hver enkelt fluorofore, og hvordan forskellige lasere kan interagere med den pågældende fluorofore. I en flowcytometri-maskine udsender argon-ionlaseren f.eks. lys på 488 nm, som exciterer fluoroforen, fluoresceinisothiocyanat (FITC). Da 488 nm ligger meget tæt på FITC’s absorptionsmaksimum, resulterer exciteringen i en høj FITC-emission. Hvis FITC imidlertid exciteres af en anden bølgelængde fra en anden laser inden for dens absorptionsspektrum, udsender den lys i det samme spektrum, men det er ikke af samme intensitet.
Så har du det: en hurtig introduktion/genopfriskning af fluorescens og hvordan det relaterer til fluorescerende molekyler, der anvendes i flowcytometri. Spørgsmål? Kommentarer? Lad os høre fra dig!