La fluorescenza è uno degli strumenti più importanti e utili nella cassetta degli attrezzi di un biologo. In biologia, quasi ogni campo, dalla fisiologia all’immunologia, usa molecole fluorescenti (alias fluorofori) per rilevare le proteine. Tuttavia, la scienza specifica dietro a come funziona la fluorescenza può essere confusa o trascurata.
Non temere! In questo articolo, abbiamo analizzato i punti chiave della fluorescenza in modo che tu possa essere l’esperto che hai sempre voluto essere.
Cosa è esattamente la fluorescenza?
Per definizione, la fluorescenza è un tipo di fotoluminescenza, ovvero ciò che accade quando una molecola viene eccitata da fotoni ultravioletti o di luce visibile. Più specificamente, la fluorescenza è il risultato di una molecola che assorbe luce ad una specifica lunghezza d’onda ed emette luce ad una lunghezza d’onda più lunga.
Dettagli, per favore
Grazie a Dio, questo argomento è quello a cui il dottor Aleksander Jablonski ha dedicato la sua vita. Alla fine ha sviluppato il diagramma di Jablonski per descrivere l’assorbimento e l’emissione della luce. In breve, le 3 fasi della fluorescenza sono l’assorbimento (o eccitazione), la transizione non radiativa (o durata dello stato eccitato) e l’emissione di fluorescenza.1
Figura 1. Diagramma di Jablonski. S0 e S1 rappresentano diversi stati elettronici. Gli altri numeri (qui 0-3) rappresentano gli stati vibrazionali. Per gentile concessione di Jacobkhed.
Passo 1: Eccitazione
Flashback alla chimica generale: la luce visibile esiste come particelle elementari chiamate fotoni. Queste particelle sono pacchetti essenziali di energia che, quando vengono assorbite, spingono o “eccitano” la molecola che assorbe la luce in un livello di energia superiore. Nel caso della fluorescenza, i fluorofori assorbono la luce visibile, di solito fornita da una lampada ad incandescenza o da un laser, portando ad uno stato elettronico eccitato di singoletto (S1) della molecola.
Step 2: Durata dello stato eccitato
Come tutti sappiamo, l’obiettivo di un atomo è quello di essere nello stato energetico più basso possibile. Così, quando un fluoroforo viene eccitato ad uno stato elettronico superiore, vuole immediatamente iniziare a rilasciare energia; così, questo stato eccitato, noto come la durata dello stato eccitato, non dura molto a lungo (in genere 1-10 nanosecondi). Anche così, questa fase del processo è incredibilmente importante, poiché è durante questo tempo che l’energia di S1 comincia a decadere verso uno stato eccitato singoletto “rilassato” da cui ha origine l’emissione di fluorescenza.
Fase 3: Emissione
E finalmente, siamo pronti per la fluorescenza! Partendo dallo stato eccitato “rilassato”, il fotone ad alta energia decade rapidamente verso lo stato fondamentale ed emette questa energia in eccesso come un fotone di luce. Questa transizione di energia è ciò che conosciamo come fluorescenza. È interessante notare che, poiché una parte di quell’energia è già stata rilasciata durante la vita dello stato eccitato, l’energia del fotone che ora sta fluorescendo è inferiore all’energia del fotone di eccitazione. Quindi, l’energia rilasciata durante la fluorescenza sarà sempre di una lunghezza d’onda più lunga di quella necessaria per l’eccitazione.
Come la citometria a flusso sfrutta le molecole fluorescenti?
Abbiamo trattato il concetto e le basi della citometria a flusso in articoli precedenti e in un webinar, quindi torna indietro e rinfrescati l’argomento se ne hai bisogno.
Pronto? Andiamo!
Quando abbiamo a che fare con molecole fluorescenti, dobbiamo prestare particolare attenzione alla differenza tra le lunghezze d’onda o l’energia di eccitazione ed emissione, altrimenti nota come spostamento di Stokes. L’importanza dello spostamento di Stokes sta nella sua semplicità: ci permette di determinare se la lunghezza d’onda della luce emessa e la lunghezza d’onda della luce di eccitazione sono abbastanza grandi da distinguerle in modo affidabile. Poiché la lettura della citometria a flusso si basa esclusivamente sulla fluorescenza, è essenziale essere consapevoli di questo parametro, o si rischia di generare dati inaffidabili, emoji di cacca.
Inoltre, è estremamente importante tenere traccia dello spettro di assorbimento e di emissione per ogni fluoroforo, e come vari laser possono interagire con il fluoroforo in questione. Per esempio, in una macchina per citometria a flusso il laser a ioni d’argon emette 488-nm di luce, che eccita il fluoroforo, isotiocianato di fluoresceina (FITC). Poiché i 488-nm sono molto vicini al massimo di assorbimento del FITC, l’eccitazione provoca un’elevata emissione di FITC. Tuttavia, se il FITC è eccitato da un’altra lunghezza d’onda da un laser diverso all’interno del suo spettro di assorbimento, emette luce nello stesso spettro, ma non è della stessa intensità.
Ecco qui: una rapida introduzione/ricordo della fluorescenza e come si riferisce alle molecole fluorescenti utilizzate nella citometria a flusso. Domande? Commenti? Fateci sapere!