Vurdering af risikoen ved kobberoverskud i menneskelige populationer

ABSTRACT

Risikovurdering for næringsstoffer forudsætter en enkelt population med en normal fordeling af indeks for behov og overskud. Toxiske niveauer er pr. definition indtag over det øvre niveau; for kobber er overskridelsen imidlertid baseret på sjældne kliniske sygdomme som f.eks. uforklarlig levercirrhose, fordi vi mangler ikke-invasive, følsomme biomarkører for lagring eller tidlig skade som følge af overskridelse, fordi vi mangler ikke-invasive, følsomme biomarkører for lagring eller tidlig skade som følge af overskridelse. Vi undersøger begrænsningerne ved denne fremgangsmåde for kobber i betragtning af den meget lave prævalens af klinisk og subklinisk sygdom og foreslår, at befolkningsrisikoen for kobberoverskud baseres på hepatisk kobberbelastning som en potentielt kvantificerbar måling. Den fremtidige udfordring består i at udvikle biomarkører, der kan forudsige befolkningsrisikoen for forhøjede hepatiske kobberlagre og dermed muligheden for sygdom i en befolkning.

INDLEDNING

Traditionel risikovurdering af næringsstofunderskud og -overskud forudsætter en enkelt befolkning med behov, der følger en normalfordeling; på grundlag heraf fastsættes et gennemsnitligt behov og et anbefalet indtag til dækning af en fast (97,5) procentdel af gruppen. Et øvre niveau definerer den øvre ende af det interval, der anses for sikkert. Toxiske niveauer er pr. definition indtag, der ligger over det øvre niveau. Vi undersøger begrænsningerne ved at anvende denne fremgangsmåde på kobber i betragtning af kendte og potentielt modtagelige befolkningsgrupper og foreslår en potentiel metode til kvantificering af befolkningsrisikoen ved kobberoverskud på grundlag af de foreliggende data.

Beviset for kobbers ernæringsmæssige væsentlighed for mennesker er etableret på grundlag af tilstedeværelsen af kobber i kroppen, påvisning af skadelige virkninger, hvis det fjernes fra kosten, og endelig den gavnlige virkning af at genindføre det. Helkroppens kobberindhold hos voksne er ≈80 mg (interval: 50-120 mg), og de højeste koncentrationer findes i lever og hjerne (henholdsvis 5,1 og 6,3 μg/g vådvægt; 1, 2). Lever kobber repræsenterer den vigtigste lagringsform, mens det høje indhold i hjernens basalganglier forklares med kobbers rolle i neurotransmittermetabolismen. Patienter, der modtager intravenøs ernæring uden tilførsel af mineraler, udvikler mangel og udviser anæmi og neutropeni inden for et par uger efter kobbermangel, som vendes ved tilførsel af kobber (2). Kobberbehovet og dets grundlag samt potentialet for mangel og overskud er præsenteret i andre artikler i dette tillæg.

Mennesker kan tilpasse sig til overdreven kobbereksponering fra mad, vand eller kosttilskud ved at nedsætte den absorberede fraktion, efterhånden som eksponeringen stiger (3, 4). Nogle metaller og andre kostkomponenter forstyrrer kobberoptagelsen, mens protein og histidin øger optagelsen. Som påpeget i afsnittet i dette tillæg om tarmens kobbermetabolisme er tarmen ikke kun ansvarlig for den regulerede kobberoptagelse, men tjener også som et sted for opbevaring og forhindrer således, at overskydende kobber kommer ind i portalblodet. Under normale forhold sker overførslen af kobber til leveren i kompleksform med proteiner via portblodet. Kobber i enterocytten er hovedsageligt bundet til metallothionein. Hvis metallothioneinets bindingskapacitet af en eller anden grund overskrides, denatureres metallothionein, hvorved det mister sin evne til at binde kobber, og celledød indtræder. Dette er faktisk en yderligere potentiel beskyttelsesmekanisme i tarmen, som udgør en første forsvarslinje mod kobberoverskud (4, 5).

Kobberoptagelse fra portalkredsløbet sker i de fenestrerede kapillærer; hepatocytter og Kupferceller udsættes således for kobber. Når kobberet kommer ind i hepatocytten via specifikke transportører (CTR1, ATP7A), optages det af specifikke chaperoner, der definerer metallets endelige destination i form af funktionelle proteiner, hvoraf cytochrom c oxidase, superoxid dismutase og ceruloplasmin er de vigtigste. Overskydende kobber bindes til metallothionein, mens det kobber, der er nødvendigt for ferroxidaseaktiviteten, overføres til Golgi med det tilsvarende apo-ceruloplasmin med henblik på eksport til andre organer via den systemiske cirkulation. Kobber udskilles således fra leveren til det systemiske kredsløb overvejende bundet til ceruloplasmin eller bundet til små peptider. Cellulær optagelse i nogle væv formidles af specifikke ceruloplasminreceptorer på celleoverfladen. Hvis der er overskud af kobber i hepatocytterne, translokeres ATP7B fra Golgi til et vesikulært transportsystem, der er ansvarligt for transporten, og det udskilles i galdekanalerne. Kobber kan også udskilles til canaliculi bundet til glutathion eller lagres i lysosomer bundet til metallothionein eller til lysosomale proteiner (6, 7). Den nøjagtige fordeling af kobber i disse alternative transportsystemer er ikke kendt, men tilsyneladende induceres den lysosomale udskillelsesvej kun ved tilstedeværelse af overskud af leverkobber. Galdeudskillelse er den vigtigste form for kobberudskillelse hos mennesker og er den kritiske forebyggende faktor som reaktion på en høj eksponering (7, 8). Dette system kræver ikke kun tilstedeværelsen af de respektive kobberrelaterede proteiner og det af Golgi afledte vesikulære system, men også de cytoskeletale strukturelle proteiner, der er nødvendige for sekretion i canaliculi (7, 8). Dette indviklede, redundante system forklarer vanskeligheden ved at fremkalde kobberoverskud i leveren; matematisk modellering af de biologiske reaktioner fra enterocytreguleringsreaktionerne og leverens optagelses-, lagrings- og udskillelsessystem baseret på faktiske data tyder på, at raske menneskers evne til at tilpasse sig til kobberoverskud er mindst 10 gange større end det daglige kobberbehov (5-9). De homeostatiske data forudsiger, at leverlagrene vil stige; men hvis udskillelsesvejene er intakte, vil galdeudskillelsen stige lineært ved eksponeringer på op til 20-30 gange det gennemsnitlige behov uden tegn på skadelige virkninger.

RISIKO AF KØBERFORHØJELSE

Det er >80 år siden, at London-neurologen SAK Wilson definerede et familiært syndrom med progressiv lenticular degeneration i forbindelse med levercirrose. Wilson-sygdommen er nu anerkendt som en autosomal recessiv genetisk sygdom, der er karakteriseret ved en defekt i kobberets galdeudskillelse; kobberet ophobes i lever og hjerne og forårsager ændret struktur og funktion i disse organer (10). Der er gjort betydelige fremskridt med hensyn til at klarlægge de kliniske, biokemiske, genetiske og histologiske træk samt behandlingen af patienter med denne sygdom. Kloningen af Wilson-sygdomsgenet har fremskyndet vores forståelse af sygdommen, men der er endnu ikke fundet en løsning på problemet med udbredt anvendelse af genetisk screening. Genet for Wilsons sygdom er udbredt over hele verden og er blevet påvist i de fleste racer. Det nuværende prævalensestimat er ≈1:30 000 levende fødsler; genfrekvensen varierer mellem 0,3 % og 0,7 % svarende til en heterozygot bærerrate på ≈1:100.

Andre eksempler på kronisk kobberforgiftning omfatter indisk børnecirrhose og tyrolsk infantil cirrose (11, 12); disse tilfælde er relateret til høj eksponering for kobber på grund af animalsk mælk, der opbevares eller opvarmes i beholdere af kobber eller kobberlegeringer. Indtag i forbindelse med skrumpelever er normalt 50-100 gange højere end det, som et ammet spædbarn får; genetisk modtagelighed kan bidrage til at forklare den individuelle risiko. Kobber kan virke i synergi med miljøgifte. Disse usædvanlige tilfælde involverer enten ekstremt høj eksponering for kobber (11, 12) eller ukonventionelle kostvaner som f.eks. indtagelse af kosttilskud uden lægelig godkendelse. Kobberassocieret infantil cirrose er en ekstremt sjælden tilstand; for idiopatisk kobberforgiftning er den anslåede incidens baseret på prospektive data fra Tyskland 1:500 000 til 1:1 000 000 000 (13). Dataene for indisk børnecirrhose fra Indien viser en dramatisk nedgang i denne tilstand som følge af, at man har undgået at anvende kobberbeholdere til opbevaring og opvarmning af mælk. Nyere observationer fra Pune-distriktet baseret på hospitalsindlæggelser viser et stort fald i prævalensen; der er ikke blevet diagnosticeret nogen tilfælde siden 1974 (11). Det kan konkluderes, at indisk børnecirrhose/idiopatisk kobberforgiftning er en sygdom af ukendt ætiologi. Den mest sandsynlige forklaring på denne tilstand synes at være en kombination af en genetisk betinget defekt i kobbermetabolismen og et højt kobberindtag. De enkelte faktorers relative bidrag er endnu ikke fastlagt; risikostyring i dette tilfælde omfatter praktisk rådgivning og udbredelse af eksisterende retningslinjer.

Den langsigtede toksicitet af kobber ved moderat høj eksponering er blevet mindre undersøgt. En undersøgelse udført i 7 byer i Massachusetts med i alt 64 124 børneår med eksponering af børn under 6 år med kobberkoncentrationer i drikkevandet på mellem 8,4 og 8,8 mg/L viste ikke en højere prævalens af dødsfald som følge af leversygdomme (14) end i byer med lav kobberkoncentration i drikkevandet. En systematisk evaluering af sammenhængen mellem leverlidelser hos børn og kobberindholdet i drikkevandet i Det Forenede Kongerige viste ingen sammenhæng mellem disse variabler (15). Det acceptable indtag for at forebygge kobbermangel og -toksicitet bør være baseret på beskyttelse af sunde befolkningsgrupper og bør ikke forventes at opfylde kravene eller forebygge overskud hos personer med særlig modtagelighed. Sygdomstilstande eller genetiske ændringer i kobbermetabolismen, der bestemmer særlig følsomhed over for over- eller underskud, fortjener folkesundhedsmyndighedernes opmærksomhed på grundlag af disse tilstandes relevans inden for en given økologisk kontekst. De øvre og nedre grænseværdier for det acceptable orale indtag er defineret ved hjælp af en befolkningsbaseret model til vurdering af de sundhedsrisici, der er forbundet med mangel eller overskud. Den nedre grænseværdi bør være tilstrækkelig til at opfylde behovene hos de fleste personer i befolkningen. På samme måde bør den øvre grænseværdi beskytte de fleste personer mod risikoen for toksicitet. Denne homøostatiske risikovurderingsmodel, som kan anvendes på essentielle grundstoffer, er blevet foreslået af Verdenssundhedsorganisationens internationale program for kemikaliesikkerhed som grundlag for risikovurdering af essentielle grundstoffer (16).

EXPOSITION FOR EKSPONERING FOR EKSTRA KØBER

Befolkningens eksponering for kobber sker hovedsageligt gennem drikkevand og afhænger af flere faktorer: vandets sammensætning, den stillestående kontakttid mellem vand og rør, rørets alder, installationsprocedurerne for kobberrør, brugen af kobberrør i vandforsyningsnet og befolkningens drikkevaner. Koncentrationen af kobber efter transport og distribution af vand i et kobberrør afhænger af vandets kemiske sammensætning, især dets pH-værdi og alkalinitet. Andre sammensætningsvariabler som f.eks. opløst uorganisk kulstof, organiske stoffer og andre forbindelser spiller også en rolle for frigivelsen af kobberbiprodukter (17, 18). Figur 1 illustrerer den kumulative fordeling af kobbereksponering fra fødevarer og vand (brudte linjer) i forhold til befolkningsfordelinger af fysiologiske behov eller af toksiske mængder repræsenteret ved de klokkeformede kurver.

Risiko for kobberoverskud i tilsyneladende sunde menneskepopulationer kan antages under relativt sjældne eksponeringsbetingelser. Disse omfatter følgende. 1) Populationer, der udsættes for høj kobberindtagelse, dvs. personer, der indtager vand, der indeholder >5 mg Cu/L, eller personer i den generelle befolkning med høj indtagelse af kobber fra fødevarer eller kosttilskud med højt kobberindhold, kan være i risiko for kobberoverskud. Fødevarer kan tegne sig for >90 % af kobberindtaget hos voksne, hvis vandet har et lavt kobberindhold (<0,1 mg/L). Hvis vandets kobberindhold er højere (1-2 mg/L), kan det tegne sig for op til 50 % af det samlede indtag. Hos spædbørn, der indtager kobbertilskudt kunstigt modermælkserstatning, kan vandets bidrag være <10 %, mens hvis modermælkserstatningen ikke er beriget med kobber, kan vand bidrage med >50 % af det samlede kobberindtag, især hvis vandets kobberindhold er 1-2 mg/L (19). Situationen for personer, der indtager kobber som tilskud, er forskellig; der findes i litteraturen en rapport om et tilfælde beskrevet af O’Donohue et al (20) om en mand, der efter at have indtaget et tilskud på 30 mg/d i 2 år og derefter 60 mg/d i det følgende år, hvilket svarer til et anslået indtag på 600-900 μ g – kg-1 – d-1, udviklede alvorlig leversvigt og krævede en levertransplantation for at overleve.

2) Modermælkserstattende spædbørn, der indtager pulverformuleret modermælkserstatning indeholdende kobber og ledningsvand indeholdende >2 mg/L, kan også overskride Verdenssundhedsorganisationens øvre grænse på 150 μg – kg-1 – d-1. En kontrolleret undersøgelse af en gruppe på 100 raske spædbørn, der i 1 år indtog næsten det dobbelte af denne mængde i 1 år fra vand med 2 mg Cu/L, gav imidlertid ingen biokemiske eller kliniske tegn på sundhedsproblemer (19). Befolkningsbaserede undersøgelser i Tyskland kunne heller ikke påvise en sammenhæng mellem kobbereksponering fra vand med koncentrationer på ≈0,8 mg/L og kliniske eller laboratoriemæssige tegn på leveranomalier (21).

3) Endelig kan befolkningsgrupper, der kan have større modtagelighed for kobberoverskud som følge af genetiske defekter eller interaktioner mellem gener og næringsstoffer, f.eks. personer, der er heterozygote for Wilson-sygdom-genet, være i risiko for kobberoverskud (se B i figur 1). Denne gruppe kan udgøre op til 1 % af den almindelige befolkning, når man tager hensyn til forekomsten af Wilson-sygdom i de forskellige geografiske regioner. Indtil videre er det uvist, om disse personer har en øget modtagelighed for at akkumulere kobber under eksponeringer, der anses for sikre for den almindelige befolkning.

Langtidssikkerhedsdata for normale befolkningsgrupper er begrænsede, og prospektive undersøgelser, der kontrollerer eksponeringen over tid, er ekstremt vanskelige at gennemføre. Der er gennemført kontrollerede undersøgelser over 3-6 måneder, hvor man har vurderet reaktioner på eksponering for 8-10 mg Cu/d (22, 23). De nuværende øvre grænseværdier for kobber er 8-10 mg/d; dette udgør grænsen for, hvad der etisk set kan vurderes hos normale mennesker. Det er således muligvis ikke muligt at påvise beviser for klassisk sygdom, medmindre genetiske faktorer betinges af øget modtagelighed. Markører til vurdering af de tidlige virkninger af overdreven ophobning af kobber, før der opstår patologiske ændringer, kan måske gøre det muligt at vurdere risikoen på en etisk forsvarlig og gyldig måde. Hvis en sådan markør var tilgængelig, kunne der gennemføres en effektiv risikostyring rettet mod modtagelige individer eller befolkningsgrupper. Desværre kan problemet ikke løses ved hjælp af eksponeringsmarkører; der er behov for specifikke biomarkører for kobberbelastning i leveren, som kan forudsige oplagring på niveauer, der er forenelige med levercirrhose. Selv markører for subklinisk sygdom ville være utilstrækkelige, for når først den inflammatoriske proces, der fører til fibrose, er udløst, er det måske for sent til at iværksætte forebyggende foranstaltninger.

KVALIFICERING AF RISIKOEN FOR KØBERUDDANNELSE

På nuværende tidspunkt er den eneste markør for leverens kobberoverbelastning den seriemåling af kobberindholdet, der foretages i leverbiopsier. Det normale kobberindhold i leveren varierer fra 15 til 55 μg/g tør lever. Stort set alle ubehandlede patienter med Wilsons sygdom har forhøjede hepatiske kobberkoncentrationer, der varierer fra 250 til 3000 μg/g tør lever. Hvis der konstateres en normal hepatisk kobberkoncentration, kan diagnosen ubehandlet Wilsons sygdom effektivt udelukkes. En forhøjet kobberkoncentration i leveren er imidlertid ikke i sig selv tilstrækkelig til at stille diagnosen Wilson-sygdom, da der kan findes koncentrationer >250 μg/g ved andre kroniske leverlidelser, herunder primær biliær cirrose, primær skleroserende kolangitis, ekstrahepatisk biliær obstruktion eller atresi, kronisk aktiv hepatitis, intrahepatisk kolestase i barndommen og indisk børnecirrhose. En alternativ markør kunne være koncentrationen og mætningsgraden af ceruloplasmin; desværre reagerer denne indikator på et lavt kobberindtag, men stiger ikke ved overskud af kobber. Den normale serumkoncentration af ceruloplasmin er 200 til 400 mg/L; selv om koncentrationerne er lave hos nyfødte mennesker, stiger de gradvist i løbet af de første 2 år af livet, hvilket falder sammen med det postnatale fald i leverens kobberkoncentration. Koncentrationerne er under normalområdet hos ≈90% af alle patienter med Wilsons sygdom. Der kan opstå vanskeligheder med hensyn til de 10 % heterozygote bærere af genet for Wilsons sygdom, som udviser nedsatte serumkoncentrationer af ceruloplasmin, men som aldrig udvikler kliniske symptomer eller tegn på sygdommen. Disse personer, som udgør ≈1:2000 personer i den almindelige befolkning, kan udgøre et vanskeligt diagnostisk dilemma, hvis de tilfældigvis udvikler hepatitis eller cirrose sekundært til andre ætiologier og derved efterligner de kliniske, biokemiske og histologiske træk ved Wilsons sygdom.

Systematiske undersøgelser på mennesker tyder på, at indtagelse af drikkevarer eller drikkevand med kobber i over 5-6 mg/L resulterer i kvalme, opkastning og diarré hos >5% af de udsatte (24). Derfor er Verdenssundhedsorganisationens nuværende retningslinje for drikkevand blevet fastsat til 2 mg/L. Dette tal blev anset for at være sikkert for kronisk eksponering af befolkningen, fordi der indtil videre ikke foreligger beviser for det modsatte, undtagen for patienter med Wilsons sygdom (24). En ekspertgruppe under US National Academy of Science bad imidlertid om at undersøge, om den amerikanske grænseværdi på 1,3 mg Cu/L i vand kunne hæves til 2 mg/L, idet kun halvdelen af eksperterne accepterede den foreslåede ændring (25, 26). Den resterende halvdel var bekymret over potentielle kroniske sundhedsvirkninger på grund af den usikre hyppighed af genetisk modtagelighed. De mente, at op til 1 % af befolkningen var heterozygot for Wilson-sygdom-genet, og at yderligere 1 % potentielt kunne have andre modtagelighedsgener, hvorfor der er behov for at definere den langsigtede virkning af dette eksponeringsniveau hos genetisk modtagelige individer.

Selv om vi havde den perfekte markør for Wilson-sygdom med en 100 % forudsigelseskraft, ville det kræve en stor stikprøvestørrelse at påvise tilstedeværelsen eller fraværet af risiko med tilstrækkelig styrke til at styre forebyggende foranstaltninger på befolkningsniveau. Tabel 1 viser den specifikke risiko for forskellige potentielle kliniske og subkliniske endepunkter og den samlede befolkningsrisiko for enhver målbar effekt under hensyntagen til forskellige eksponeringsniveauer i befolkningen baseret på den model, der er præsenteret i figur 1. Slutpunkterne er baseret på de kendte frekvenser af genetiske defekter, som definerer øget modtagelighed ved lavere eksponeringsniveauer. Det er tydeligt, at det ved sædvanlige eksponeringer vil være yderst sjældent at finde kliniske tegn eller endog subkliniske tegn; det eneste følsomme mål for kobberoverskud vil derfor være indekser, der forudsiger kobberbelastning af leveren. Hvis f.eks. prævalensen af heterozygote individer er 1 %, og alle dem, der bærer et abnormt gen, har overdreven kobberakkumulering i leveren, ville vi, forudsat at vi havde den perfekte biomarkør, have brug for >3000 personer for med 90 % effekt og 0,05 signifikans at påvise en relativ risiko på 2:1 for akkumulering af overskydende kobber i forhold til det normale. Hvis den relative risiko var 10:1, ville vi have brug for noget færre forsøgspersoner (27). Hvis vi imidlertid valgte levercirrhose som det relevante resultat, ville vi have brug for mellem 100 000 og 500 000 forsøgspersoner for at påvise en relativ risiko på 10:1 med 90 % effekt og en signifikans på <0,05. Dette store antal er nødvendigt, fordi cirrose stadig ville være ret sjældent, måske højst 1 pr. 10 000, når man tager i betragtning, at homozygote tilstande i gennemsnit kun manifesterer sig klinisk i 1 ud af 30 000 tilfælde. Disse tal ville være endnu større, hvis kun en brøkdel af befolkningen er udsat for det givne kobberniveau (27).

KONKLUSIONER

Prævalensen af kliniske og subkliniske sygdomme i forbindelse med kobberoverskud er ekstremt lav; derfor er det antal eksponerede personer, der kræves for at definere risikoen, meget højt (≈500.000). Befolkningsrisikoen for kobberoverskud bør vurderes på grundlag af hepatisk kobberbelastning som et potentielt målbart resultat, da dette potentielt er mere hyppigt forekommende. Udfordringen er at udvikle biomarkører for overskud, der forudsiger befolkningsrisikoen for at finde et hepatisk kobberindhold på >250 μg/g levertørvægt ved et givet kobbereksponeringsniveau.

Forfatternes bidrag var som følger: RU og MA gennemgik emnet, konceptualiserede problemet og skrev artiklen i fællesskab; AM og RU definerede fremgangsmåden, antagelserne og de beregninger, der blev fulgt i vurderingen af befolkningsrisikoen for kobberoverskud.

Forfatterne havde ingen direkte interessekonflikter. Der blev modtaget delvis støtte fra International Copper Association.

FOOTNOTER