Am 8. Dezember 1542 im Schloss Linlithgow in West Lothian geboren, wurde Maria im Alter von sechs Tagen Königin der Schotten.
Ihre Ansprüche auf den englischen Thron waren fast so stark wie ihre Ansprüche auf den schottischen Thron. Als Urenkelin Heinrichs VII. von England war Maria nach den Kindern Heinrichs VIII. die nächste in der Linie auf den englischen Thron.
Aufgrund ihrer Jugend und ihres Geschlechts beschloss der schottische Adel, mit England Frieden zu schließen, und sie einigten sich darauf, dass sie den Sohn Heinrichs VIII., den zukünftigen Eduard VI. heiraten sollte.
Kaum war der Vertrag jedoch geschlossen, brachten die Katholiken, die gegen den Plan waren, die junge Maria nach Stirling Castle, und zum Zorn Heinrichs brachen sie die Ehe und zogen es vor, zum traditionellen Bündnis Schottlands mit Frankreich zurückzukehren.
Henry befahl daraufhin eine Reihe wilder Überfälle in Schottland, die als „The Rough Wooing“ bekannt wurden. Seine Armee setzte die Abtei von Holyroodhouse, in der Jakob V. begraben war, in Brand, verbrannte Ernten im Tweed-Tal und setzte die Grenzklöster Melrose, Jedburgh und Dryburgh in Brand.
Die Schotten ließen sich davon nicht beirren und verlobten Maria 1548 mit dem Erben des französischen Königs Heinrich II, dem Dauphin Francis, und schickten sie zur Erziehung an den französischen Hof. Es heißt, dass die Schreibweise des königlichen Familiennamens Stewart zu dieser Zeit in Stuart geändert wurde, um der in Frankreich üblichen Schreibweise zu entsprechen.
Die große, grazile und schlagfertige Maria heiratete den Dauphin am 24. April 1558 in Paris. Er bestieg 1559 den Thron seines Vaters und machte Maria zur Königin von Frankreich und Schottland, doch seine Regentschaft war kurz, denn er starb 1560 an einer Ohrenentzündung.
Im folgenden Jahr beschloss Maria trotz der Warnungen ihrer Freunde, nach Schottland zurückzukehren, das nach den religiösen Reformen von John Knox nun offiziell protestantisch war.
Sie war römisch-katholisch, aber ihr Halbbruder Lord James Stewart, der spätere Earl of Moray, hatte ihr versichert, dass es ihr erlaubt sein würde, ihren Glauben so zu praktizieren, wie sie es wünschte, und im August 1561 kehrte sie zurück, wo sie von ihren protestantischen Untertanen unerwartet herzlich empfangen wurde.
Zunächst regierte Mary erfolgreich und maßvoll, beraten von Lord James und William Maitland of Lethington, einem feinsinnigen Diplomaten. Ihre Heirat 1565 mit ihrem Cousin zweiten Grades Henry, Lord Darnley (Urenkel Heinrichs VII.), leitete jedoch eine tragische Reihe von Ereignissen ein, die durch streitsüchtige schottische Adlige noch verschlimmert wurden.
Verschmäht und launisch wurde Darnley zum Werkzeug von Marias Feinden und brach mit einer Gruppe von Verschwörern in ihr Abendmahlszimmer ein, bedrohte die hochschwangere Königin und ermordete am 9. März 1566 im Palast von Holyroodhouse ihren Sekretär David Riccio.
Die Geburt von Marys und Darnleys Sohn James in jenem Sommer trug nicht zur Verbesserung ihrer Beziehung bei, und als Darnley am 10. Februar 1567 in Kirk o’Field vor den Mauern von Edinburgh ermordet wurde, vermutete man, dass sie in das Verbrechen verwickelt war.
Ihre anschließende Heirat drei Monate später mit dem Earl of Bothwell (von dem man allgemein annimmt, dass er der Hauptmörder war) brachte ihr unweigerlich den Ruin. Ihre protestantischen Lords erhoben sich gegen sie, und ihre Armee stellte sich am 15. Juni 1567 am Carberry Hill in der Nähe von Edinburgh den ihren entgegen.
Sie kapitulierte, wurde in Lochleven Castle, Kinross-shire, gefangen gehalten und gezwungen, zugunsten ihres kleinen Sohnes abzudanken. Bothwell floh nach Skandinavien, wo er verhaftet und bis zu seinem Tod gefangen gehalten wurde.
Mary entkam 1568 aus Lochleven, wurde aber am 13. Mai in der Schlacht von Langside bei Glasgow besiegt. Sie floh nach Süden und suchte Schutz in England, weil sie glaubte, dass Königin Elisabeth I. ihre Sache unterstützen würde, aber stattdessen wurde sie 19 Jahre lang in England gefangen gehalten.
Im Mittelpunkt einer langen Reihe römisch-katholischer Verschwörungen gegen Elisabeth, die im Babington-Komplott zur Ermordung der englischen Königin gipfelten, forderten Elisabeths Minister die Hinrichtung Marias: „Solange sie lebt, gibt es Hoffnung; so wie sie in der Hoffnung leben, leben wir in der Angst“.
Mary wurde schließlich am 8. Februar 1587, im Alter von 44 Jahren, auf Schloss Fotheringhay in Northamptonshire hingerichtet.
Sie wurde in der Kathedrale von Peterborough beigesetzt, aber 1612 ließ ihr Sohn James VI. und I. ihren Leichnam exhumieren und in die Gruft der Kapelle von König Henry VII. in der Westminster Abbey legen.