5.5.9 Der Tricarbonsäurezyklus
Pyruvat steht an der Verzweigungsstelle der katabolen Sequenz des oxidativen Glukosestoffwechsels im TCA-Zyklus und des gluconeogenen Weges aus C3-Vorstufen. In beiden Wegen gelangt Pyruvat in den TCA-Zyklus, wo es entweder über Pyruvatdehydrogenase oxidativ zu Acetyl-CoA decarboxyliert oder in der Pyruvatcarboxylase-Reaktion zu Oxalacetat carboxyliert wird. Da PC und PDH um Pyruvat konkurrieren, nehmen sie eine Schlüsselposition bei der Regulierung des anaplerotischen (d. h. auffüllenden) bzw. oxidativen Stoffwechsels ein. Cohen und Mitarbeiter (1979b; Cohen, 1983, 1987a,b,c) verwendeten Kombinationen von markiertem und unmarkiertem Alanin oder Pyruvat und Ethanol, um die hepatische Substratkonkurrenz um den Eintritt in den TCA-Zyklus unter verschiedenen hormonellen und diätetischen Bedingungen in perfundierten Ratten- und Mauslebern zu untersuchen.
Wenn Alanin das einzige hepatische Substrat war, wurden C2, C3 und C4 von Glutamat und Glutamin leicht markiert, wie es von der Topologie des TCA-Zyklus erwartet wird (Cohen et al., 1979b; Cohen, 1987a). Das Alanin wird zu Pyruvat transaminiert, das entweder zu Acetyl-CoA decarboxyliert oder zu Oxalacetat carboxyliert wird. Das Acetyl-CoA wird in Citrat und anschließend in α-Ketoglutarat eingebaut, das wiederum zu Glutamat transaminiert werden kann. Oxalacetat hingegen befindet sich im Gleichgewicht mit Malat und Fumarat (siehe Abschnitt 5.5.8), und das Label wird in C2 und C3 des Oxalacetats verschlüsselt. Die Kondensation solcher Oxalacetat-Isotomere mit Acetyl-CoA in der Citrat-Synthase-Reaktion führt anschließend zu – und α-Ketoglutarat und damit zu – und Glutamat. Der relative Anteil von Pyruvat, der über PC und PDH in den TCA-Zyklus gelangt, kann daher anhand der relativen Anreicherung von Glutamat C2 und C4 geschätzt werden. Unter der Annahme eines Modells erster Ordnung, bei dem nur eine Umdrehung des TCA-Zyklus berücksichtigt und das kontinuierliche Recycling der Markierung vernachlässigt wird (siehe Abschnitt 5.3.7), berechnete Cohen (1983, 1987c) in Lebern von gut ernährten, diabetischen und 24-Stunden-fastenden Spenderratten Verhältnisse zwischen der PC- und der PDH-Flussrate, die von 1,2 bis 2,6 bzw. 7,7 reichten. In der diabetischen Leber wurde der relative Anteil des Pyruvats, der über die beiden alternativen Wege in den TCA-Zyklus geleitet wurde, durch die In-vitro-Inkubation mit Insulin nicht verändert.
Im Gegensatz zu Experimenten, bei denen Alanin das einzige Substrat für den hepatischen Stoffwechsel war, führte die Zugabe von unmarkiertem Ethanol zu Glutamat C4 und Glutamin C4, die im Wesentlichen frei von Markierungen waren (Cohen et al., 1979b). Ethanol, das leicht durch Alkoholdehydrogenase zu Acetaldehyd und dann weiter zu Acetat oxidiert wird, dient als zusätzliche Quelle für Acetyl-CoA. Die Ergebnisse zeigten, dass aus Ethanol gewonnenes Acetyl-CoA effizient mit Acetyl-CoA konkurriert, das über PDH in den TCA-Zyklus gelangt. Bei Vorhandensein einer alternativen Acetyl-CoA-Quelle gelangte Alanin also fast ausschließlich über die PC-Reaktion in den TCA-Zyklus. Darüber hinaus erhöhte die gemeinsame Zufuhr von Alanin und Ethanol die Rate des Alaninverbrauchs über die PC-Reaktion um fast 50 % im Vergleich zu Lebern, die nur mit Alanin perfundiert wurden. Dieses Ergebnis ist nicht unerwartet, wenn man bedenkt, dass die PC-Reaktion durch den Acetyl-CoA-Spiegel reguliert wird. Eine erhöhte Acetyl-CoA-Konzentration, wie sie aus dem Ethanol-Stoffwechsel zur Verfügung stand, erhöhte den Fluss durch PC, um den Oxalacetat-Pool für einen beschleunigten Verbrauch von Acetyl-CoA im TCA-Zyklus zu vergrößern. Ähnliche Experimente wurden mit markiertem Pyruvat + NH4C1 und Ethanol als Substraten durchgeführt und lieferten gleichwertige Ergebnisse (Cohen, 1987a,b). Darüber hinaus verwendeten Nedelec et al. (1990b) das von Cohen (1983) vorgeschlagene Modell, um die Auswirkungen der virusinduzierten myeloproliferativen Leukämie auf den Leberstoffwechsel zu untersuchen. Es wurde festgestellt, dass der Alaninstoffwechsel in infizierten Lebern von nüchternen Spendern ähnlich ist wie bei gefütterten Kontrollen. In den Lebern beider Gruppen war der Beitrag der PC gegenüber der PDH zum Alaninfluss in den TCA-Zyklus im Vergleich zu den nüchternen Kontrollen reduziert. Das veränderte Verhältnis von PC/PDH-Fluss in leukämischen, nüchternen Lebern wurde durch die drastisch verringerte Verfügbarkeit von Triglyceriden und damit Acetyl-CoA in diesen Organen erklärt.
13C MRS bietet die einzigartige Möglichkeit, den Stoffwechsel von Ethanol und Alanin gleichzeitig zu verfolgen (siehe Abbildung 8). In Experimenten, in denen Alanin und Ethanol als Kohlenstoffquellen verwendet wurden, wurde Acetyl-CoA mit zwei unterschiedlichen Markierungsmustern erzeugt (Cohen, 1987b). Beim Eintritt von Alanin in den TCA-Zyklus über die PDH-Reaktion wird Acetyl-CoA gebildet und Acetyl-CoA wird aus Ethanol gewonnen. Neben der Markierung von Citrat, α-Ketoglutarat, Glutamat und Glutamin an den Positionen C4 und C5 führt der Einbau von Acetyl-CoA zu typischen Spin-Kopplungen zwischen den benachbarten Kohlenstoffen C4 und C5 von Glutamat und Glutamin, die sich leicht von den Singulett-Resonanzen unterscheiden lassen, die durch den Einbau von Alanin erzeugt werden. Die Analyse des Verhältnisses von Singulett zu Multiplett in C4 von Glutamat erlaubt daher eine direkte Abschätzung der Konkurrenz zwischen Alanin und Ethanol. Die Analyse von Spin-Kopplungsmustern war auch für die Zuordnung von Glutathion-Resonanzen in 13C-MR-Spektren aus perfundierten Lebern nützlich (Cohen, 1987a). Die Spin-Kopplungsmuster, die für den Glutamylanteil in Glutathion nach der Perfusion der Leber mit 13C-markierten Vorläufern festgestellt wurden, entsprachen weitgehend dem in Glutamat beobachteten Markierungsmuster. Daraus wurde geschlossen, dass das Kohlenstoffgerüst von Glutamat intakt blieb und direkt in de novo synthetisiertes Glutathion eingebaut wurde. Chemische Verschiebungen, die in PCA-Extrakten von Lebern gemessen wurden, wiesen darauf hin, dass Glutathion in seiner reduzierten Form vorliegt.
Abgesehen von Glutamat wurde in vielen Experimenten eine Markierung von hepatischem Glutamin beobachtet. Dies ist nicht überraschend, da Glutamin leicht in der Glutaminsynthasereaktion gebildet wird. Cohen et al. (1979b) verfolgten den zeitlichen Verlauf des Markierungseinbaus in hepatisches Glutamat und Glutamin in Mäuselebern, die in Gegenwart von Alanin und markiertem oder unmarkiertem Ethanol perfundiert wurden. Unter allen untersuchten Bedingungen blieb die Anreicherung in Glutamin hinter der von Glutamat zurück, wie aus dem Verhältnis C4/C2 der 13C-MR-Signalintensitäten in Glutamat bzw. Glutamin hervorgeht. Das C4/C2-Verhältnis, das in Glutamin zu einem bestimmten Zeitpunkt beobachtet wurde, war nicht dasselbe wie das entsprechende Verhältnis in Glutamat, sondern spiegelte das Glutamat-Verhältnis von etwa 1 Stunde zuvor wider. Diese Zeitdifferenz wurde als Maß für den Fluss durch die allosterisch kontrollierte Glutaminsynthase-Reaktion in vivo verwendet. Ähnliche Ergebnisse wurden an mit Acetat perfundierten Rattenlebern erzielt (Desmoulin et al., 1985; Canioni et al., 1985). Die Interpretation der Markierung von Glutamat und Glutamin wurde jedoch noch einen Schritt weitergeführt. Die Autoren schlugen vor, dass Glutamat und Glutamin an einem vergeblichen Zyklus teilnehmen könnten, der die Aktivitäten der zytosolischen Glutaminsynthase, der mitochondrialen Glutaminase und des Glutamat/Glutamin-Austauschs durch die mitochondrialen Membranen umfasst.
In nüchternen Lebern, die mit Alanin und Ethanol oder Pyruvat, Ammoniumchlorid und Ethanol perfundiert wurden, konnten Aspartat und N-Carbamoylaspartat, die an C2 und C3 markiert waren, nachgewiesen werden (Cohen, 1987a). Der Nachweis von markiertem Aspartat ist nicht unerwartet, da es leicht durch die Transaminierung des TCA-Zyklus-Zwischenprodukts Oxalacetat gebildet wird. N-Carbamoylaspartat wird jedoch in der Leber in einem der ersten Schritte der De-novo-Synthese von Pyrimidinnukleotiden gebildet. In N-Carbamoylaspartat ist die intakte Aspartatkomponente eingebaut, was zu dem beobachteten Markierungsmuster führt. Der weitere Nachweis von 13C-Markierung in den Endprodukten des Weges, wie z.B. Uridin und seinen Phosphorylierungsprodukten, deutet darauf hin, dass eine Nettosynthese von N-Carbamoylaspartat, im Gegensatz zum Umsatz, in perfundierten Lebern beobachtet wurde (Cohen, 1987a).