El ensayo inmunoenzimático (ELISA) es un ensayo inmunológico comúnmente utilizado para medir anticuerpos, antígenos, proteínas y glicoproteínas en muestras biológicas. Algunos ejemplos son: el diagnóstico de la infección por VIH, las pruebas de embarazo y la medición de citoquinas o receptores solubles en el sobrenadante celular o el suero. Los ensayos ELISA se realizan generalmente en placas de 96 pocillos, lo que permite medir múltiples muestras en un solo experimento. Estas placas deben ser placas absorbentes especiales (por ejemplo, placas NUNC Immuno) para garantizar que el anticuerpo o el antígeno se adhieran a la superficie. Cada ELISA mide un antígeno específico, y los kits para una variedad de antígenos están ampliamente disponibles.
El ELISA representado en la Figura 1 es lo que se conoce como ELISA en sándwich, aquí se utilizan dos conjuntos de anticuerpos para detectar productos secretados, por ejemplo, citoquinas. El método se realiza por etapas en el orden indicado. El primer paso es recubrir la placa ELISA con el anticuerpo de captura, cualquier exceso de anticuerpo no unido se lava de la placa. El anticuerpo de captura es un anticuerpo criado contra el antígeno de interés.
Figura 1. Método ELISA. Se describe un ELISA tipo sándwich, mostrando los pasos del ensayo, numerados en el orden 1-4.
A continuación se añade la muestra (por ejemplo, orina, suero o sobrenadante celular). Cualquier antígeno que se encuentre en la muestra se unirá al anticuerpo de captura que ya recubre la placa. Las muestras se añaden normalmente por duplicado o triplicado (para permitir el análisis estadístico), y en concentraciones variables para garantizar que caen dentro de los niveles de detección del ensayo. De nuevo, cualquier exceso de muestra se lava de la placa.
En el paso 3, se añade el anticuerpo de detección. Este anticuerpo está marcado con una enzima, normalmente peroxidasa de rábano o fosfatasa alcalina. El anticuerpo de detección se une a cualquier antígeno objetivo ya unido a la placa. Por último, se añade un sustrato a la placa. Los ensayos ELISA suelen ser cromogénicos y utilizan una reacción que convierte el sustrato (por ejemplo, TMB o ABTS) en un producto coloreado que puede medirse utilizando un lector de placas.
La determinación de la concentración de antígeno en una muestra requiere la producción de una curva estándar utilizando antígenos de una concentración conocida (mostrada en la Figura 2). La concentración de antígeno en una muestra puede entonces calcularse utilizando la densidad óptica (DO).
Figura 2. Una curva estándar típica. Se muestra una curva estándar para un IFN-γ ELISA. Para calcular la concentración de antígeno en una muestra, es necesario preparar una curva estándar utilizando una solución de concentración conocida.