5.5.9 Le cycle de l’acide tricarboxylique
Le pyruvate se trouve au point de branchement de la séquence catabolique du métabolisme oxydatif du glucose dans le cycle TCA et de la voie gluconéogène à partir des précurseurs C3. Dans les deux voies, le pyruvate entre dans le cycle TCA où il est soit décarboxylé par oxydation en acétyl-CoA via la pyruvate déshydrogénase, soit carboxylé en oxaloacétate dans la réaction de la pyruvate carboxylase. Comme le PC et la PDH sont en compétition pour le pyruvate, ils occupent des positions clés pour la régulation du métabolisme anaplérotique (c’est-à-dire de réapprovisionnement) et oxydatif, respectivement. Cohen et ses collègues (1979b ; Cohen, 1983, 1987a,b,c) ont utilisé des combinaisons d’alanine ou de pyruvate marqués et non marqués, et d’éthanol pour étudier la compétition hépatique des substrats pour l’entrée dans le cycle TCA sous différents états hormonaux et alimentaires de foies de rats et de souris perfusés.
Lorsque l’alanine était le seul substrat hépatique, C2, C3 et C4 du glutamate et de la glutamine étaient facilement marqués comme prévu à partir de la topologie du cycle TCA (Cohen et al, 1979b ; Cohen, 1987a). L’alanine est transaminée en pyruvate, qui est soit décarboxylé en acétyl-CoA, soit carboxylé en oxaloacétate. L’acétyl-CoA est incorporé au citrate puis à l’α-cétoglutarate qui, à son tour, peut être transaminé en glutamate. D’autre part, l’oxaloacétate est en équilibre avec le malate et le fumarate (voir section 5.5.8) et le marqueur est brouillé en C2 et C3 de l’oxaloacétate. La condensation de ces isotopomères d’oxaloacétate avec l’acétyl-CoA dans la réaction de la citrate synthase donne ensuite naissance à – et α-cétoglutarate et donc à – et glutamate. La proportion relative de pyruvate entrant dans le cycle TCA via PC et PDH peut donc être estimée par les enrichissements relatifs en glutamate C2 et C4. Dans l’hypothèse d’un modèle de premier ordre où l’on ne considère qu’un seul tour du cycle TCA et où l’on néglige le recyclage continu du marqueur (voir section 5.3.7), Cohen (1983, 1987c) a calculé des rapports du taux de flux de la PC par rapport à celui de la PDH qui variaient de 1,2 à 2,6 et 7,7 dans les foies de rats donneurs bien nourris, diabétiques et nourris pendant 24 heures, respectivement. Dans le foie diabétique, la proportion relative de pyruvate canalisé dans le cycle TCA par les deux voies alternatives n’a pas été modifiée par l’incubation in vitro avec l’insuline.
Contrairement aux expériences où l’alanine était le seul substrat du métabolisme hépatique, la coaddition d’éthanol non marqué a donné du glutamate C4 et de la glutamine C4 essentiellement dépourvus de marqueur (Cohen et al., 1979b). L’éthanol, qui est facilement oxydé par l’alcool déshydrogénase en acétaldéhyde, puis en acétate, sert de source supplémentaire d’acétyl-CoA. Les résultats indiquent que l’acétyl-CoA dérivé de l’éthanol concurrence efficacement l’acétyl-CoA entrant dans le cycle TCA via la PDH. Ainsi, en présence d’une source alternative d’acétyl-CoA, l’alanine est entrée dans le cycle TCA presque exclusivement via la réaction PC. De plus, le co-approvisionnement d’alanine avec de l’éthanol a augmenté le taux de consommation d’alanine via la réaction PC de près de 50 % par rapport aux foies perfusés avec de l’alanine seule. Ce résultat n’est pas inattendu si l’on considère que la réaction PC est régulée par le niveau d’acétyl-CoA. Une concentration élevée d’acétyl-CoA, telle qu’elle était disponible lors du métabolisme de l’éthanol, a augmenté le flux à travers le PC afin d’élargir le pool d’oxaloacétate pour une consommation accélérée d’acétyl-CoA dans le cycle TCA. Des expériences similaires avec du pyruvate marqué + NH4C1 et de l’éthanol comme substrats ont été réalisées et ont donné des résultats équivalents (Cohen, 1987a,b). De plus, Nedelec et al. (1990b) ont utilisé le modèle proposé par Cohen (1983) pour évaluer l’effet de la leucémie myéloproliférative induite par le virus sur le métabolisme hépatique. Le métabolisme de l’alanine dans les foies infectés de donneurs à jeun s’est avéré similaire à celui des témoins nourris. Les foies des deux groupes présentaient une contribution réduite de la PC par rapport à la PDH au flux d’alanine dans le cycle TCA, par rapport aux témoins à jeun. Le rapport modifié du flux PC/PDH dans les foies à jeun leucémiques a été expliqué par la disponibilité drastiquement réduite des triglycérides et donc de l’acétyl-CoA dans ces organes.
La SRM 13C offre la possibilité unique de suivre le métabolisme de l’éthanol et de l’alanine simultanément (voir figure 8). Dans les expériences où l’alanine et l’éthanol ont été utilisés comme sources de carbone, de l’acétyl-CoA avec deux schémas de marquage différents a été produit (Cohen, 1987b). Lors de l’entrée de l’alanine dans le cycle TCA via la réaction de la PDH, l’acétyl-CoA est formé et l’acétyl-CoA est dérivé de l’éthanol. En plus de marquer le citrate, l’α-cétoglutarate, le glutamate et la glutamine aux positions C4 et C5, l’incorporation d’acétyl-CoA donne lieu à des couplages de spin typiques entre les carbones C4 et C5 voisins du glutamate et de la glutamine, qui se distinguent facilement des résonances singulières générées par l’incorporation de l’alanine. Par conséquent, une estimation directe de la compétition entre l’alanine et l’éthanol peut être obtenue à partir de l’analyse du rapport singulet/multiplet en C4 du glutamate. L’analyse des modèles de couplage de spin a également été utile pour l’attribution des résonances du glutathion observées dans les spectres RM 13C obtenus à partir de foies perfusés (Cohen, 1987a). Les modèles de couplage de spin détectés pour la fraction glutamyle dans le glutathion après perfusion du foie avec des précurseurs marqués au 13C correspondaient étroitement au modèle de marquage observé dans le glutamate. On a donc conclu que le squelette carboné du glutamate est resté intact et a été directement incorporé dans le glutathion synthétisé de novo. Les déplacements chimiques mesurés dans les extraits PCA des foies ont indiqué que le glutathion est présent sous sa forme réduite.
A part le glutamate, le marquage de la glutamine hépatique a été observé dans de nombreuses expériences. Ceci n’est pas surprenant car la glutamine est facilement formée dans la réaction de la glutamine synthase. Cohen et al. (1979b) ont suivi l’évolution temporelle de l’incorporation du marqueur dans le glutamate et la glutamine hépatiques dans des foies de souris perfusés en présence d’alanine et d’éthanol marqué ou non. Dans toutes les conditions étudiées, l’enrichissement de la glutamine est resté en retrait par rapport à celui du glutamate, comme le montre le rapport C4/C2 des intensités du signal RM 13C dans le glutamate et la glutamine, respectivement. Le rapport C4/C2 observé dans la glutamine à un moment donné n’était pas le même que le rapport correspondant dans le glutamate, mais reflétait plutôt le rapport du glutamate environ 1 heure plus tôt. Cette différence de temps a été utilisée comme une mesure du flux à travers la réaction de la glutamine synthase contrôlée allostériquement in vivo. Des résultats similaires ont été obtenus à partir de foies de rat perfusés avec de l’acétate (Desmoulin et al., 1985 ; Canioni et al., 1985). Cependant, l’interprétation du marquage en glutamate et en glutamine a été poussée un peu plus loin. Les auteurs ont suggéré que le glutamate et la glutamine pourraient participer à un cycle futile, qui comprend les activités de la glutamine synthase cytosolique, de la glutaminase mitochondriale et de l’échange glutamate/glutamine à travers les membranes mitochondriales.
Dans des foies à jeun perfusés avec de l’alanine et de l’éthanol ou du pyruvate, du chlorure d’ammonium et de l’éthanol, on a pu observer de l’aspartate et du N-carbamoylaspartate marqués en C2 et C3 (Cohen, 1987a). La détection d’aspartate marqué n’est pas inattendue car il est facilement formé par la transamination de l’oxaloacétate, intermédiaire du cycle TCA. Le N-carbamoylaspartate, cependant, est produit dans le foie dans l’une des premières étapes de la synthèse de novo des nucléotides pyrimidiques. Le N-carbamoylaspartate incorpore la partie aspartate intacte, ce qui conduit au schéma de marquage observé. La détection ultérieure du marqueur 13C dans les produits finaux de la voie, tels que l’uridine et ses produits de phosphorylation, indique qu’une synthèse nette de N-carbamoylaspartate, par opposition à un renouvellement, a été observée dans les foies perfusés (Cohen, 1987a).