A fluoreszcencia az egyik legfontosabb és leghasznosabb eszköz a biológus eszköztárában. A biológiában a fiziológiától az immunológiáig szinte minden terület használ fluoreszcens molekulákat (más néven fluorofórokat) a fehérjék kimutatására. A fluoreszcencia működése mögötti konkrét tudomány azonban zavaros vagy figyelmen kívül hagyott lehet.
Ne félj! Ebben a cikkben a fluoreszcencia legfontosabb pontjait bontjuk le, hogy Ön is az a szakértő lehessen, aki mindig is szeretett volna lenni.
Mi is pontosan a fluoreszcencia?
A definíció szerint a fluoreszcencia a fotolumineszcencia egy fajtája, ami akkor történik, amikor egy molekulát ultraibolya vagy látható fény fotonjai gerjesztenek. Pontosabban, a fluoreszcencia annak az eredménye, hogy egy molekula egy bizonyos hullámhosszon elnyeli a fényt, és egy hosszabb hullámhosszon fényt bocsát ki.
Details, Please
Hála Istennek, ennek a témának szentelte életét Dr. Aleksander Jablonski. Végül kidolgozta a Jablonski-diagramot a fény abszorpciójának és emissziójának leírására. Röviden, a fluoreszcencia 3 lépése az abszorpció (vagy gerjesztés), a nem sugárzó átmenet (vagy gerjesztett állapot élettartama) és a fluoreszcencia emisszió.1
1. ábra. Jablonski-diagram. Az S0 és S1 különböző elektronállapotokat jelöl. A többi szám (itt 0-3) rezgési állapotokat jelöl. Jacobkhed jóvoltából.
1. lépés: gerjesztés
Visszatérés az általános kémiához: A látható fény fotonoknak nevezett elemi részecskék formájában létezik. Ezek a részecskék alapvető energiacsomagok, amelyek elnyelésükkor a fényt elnyelő molekulát egy magasabb energiaszintre lendítik vagy “gerjesztik”. A fluoreszcencia esetében a fluorofórok elnyelik a látható fényt, amelyet általában egy izzólámpa vagy lézer szolgáltat, ami a molekula gerjesztett elektronikus szingulett állapotába (S1) vezet.
2. lépés: gerjesztett állapot élettartama
Mint tudjuk, egy atom célja, hogy a lehető legalacsonyabb energiaállapotban legyen. Amikor tehát egy fluorofort magasabb elektronállapotba gerjesztünk, azonnal el akarja kezdeni az energia leadását; ezért ez a gerjesztett állapot, amit gerjesztett állapot élettartamnak nevezünk, nem tart túl sokáig (jellemzően 1-10 nanoszekundumig). Ennek ellenére a folyamatnak ez a lépése hihetetlenül fontos, mivel ez alatt az idő alatt az S1-ből származó energia elkezd bomlani egy “relaxált” szingulett gerjesztett állapot felé, amelyből a fluoreszcencia emisszió származik.
3. lépés: Emisszió
És végre készen állunk a fluoreszcenciára! A “relaxált” gerjesztett állapotból kiindulva a nagy energiájú foton gyorsan bomlik az alapállapot felé, és ezt a többletenergiát fényfotonként bocsátja ki. Ezt az energiaátmenetet ismerjük fluoreszcenciaként. Érdekes módon, mivel az energia egy része már a gerjesztett állapot élettartama alatt felszabadult, a most fluoreszkáló foton energiája alacsonyabb, mint a gerjesztő foton energiája. Így a fluoreszcencia során felszabaduló energia mindig hosszabb hullámhosszú lesz, mint a gerjesztéshez szükséges.
Hogyan használja ki az áramlási citometria a fluoreszcens molekulák előnyeit?
Az áramlási citometria fogalmát és alapjait korábbi cikkeinkben és egy webináriumon már tárgyaltuk, így ha szükséges, térjen vissza és frissítse fel a témát.
Készen áll? Gyerünk!
Fluoreszcens molekulákkal foglalkozva különös figyelmet kell fordítanunk a gerjesztési és az emissziós hullámhossz vagy energia közötti különbségre, más néven a Stokes-eltolódásra. A Stokes-eltolódás jelentősége az egyszerűségében rejlik: segítségével megállapíthatjuk, hogy a kibocsátott fény hullámhossza és a gerjesztő fény hullámhossza elég nagy-e ahhoz, hogy megbízhatóan meg tudjuk különböztetni őket. Mivel az áramlási citometria kiolvasása kizárólag a fluoreszcencián alapul, elengedhetetlen, hogy tisztában legyünk ezzel a paraméterrel, különben azt kockáztatjuk, hogy megbízhatatlan, kaki emoji adatokat generálunk.
Mellett rendkívül fontos nyomon követni az egyes fluorofórok abszorpciós és emissziós spektrumát, valamint azt, hogy a különböző lézerek hogyan léphetnek kölcsönhatásba a szóban forgó fluorofórral. Például egy áramlási citometriás gépben az argonion-lézer 488 nm-es fényt bocsát ki, amely gerjeszti a fluorofórt, a fluoreszcein-izotiocianátot (FITC). Mivel a 488 nm nagyon közel van a FITC abszorpciós maximumához, a gerjesztés magas FITC emissziót eredményez. Ha azonban a FITC-t egy másik hullámhosszú lézerrel gerjesztjük az abszorpciós spektrumán belül, akkor ugyanabban a spektrumban bocsát ki fényt, de az nem ugyanolyan intenzitású.
És íme: egy gyors bevezetés/emlékeztető a fluoreszcenciáról és arról, hogyan kapcsolódik az áramlási citometriában használt fluoreszcens molekulákhoz. Kérdése van? Észrevételek? Szóljon nekünk!