La traduzione è un processo che comporta la sintesi di una catena di aminoacidi da un modello di mRNA. Queste catene polipeptidiche si piegano in proteine funzionali. La traduzione avviene fuori dal nucleo una volta che l’elaborazione nucleare del pre-mRNA è completa e le molecole di mRNA sono state trasportate nel citoplasma attraverso i pori nucleari. La traduzione è principalmente facilitata dai ribosomi situati sul reticolo endoplasmatico ruvido, sulla superficie esterna dell’involucro nucleare o nel citoplasma.
- Inizio
- Prolungamento
- Terminazione
- Riciclo
Un certo numero di componenti molecolari gioca un ruolo nella traduzione, il più importante dei quali è il ribosoma. Questo complesso macromolecolare è costituito da più proteine e molecole di rRNA. Tutti i ribosomi hanno una piccola e una grande subunità, ma la composizione di queste subunità differisce sostanzialmente tra le specie. Negli esseri umani, per esempio, la piccola subunità 40S è composta da 33 proteine e una singola molecola di rRNA 18S, mentre la grande subunità 60S è composta da 47 proteine e tre rRNA (5S, 5,8S e 28S).
Nonostante l’identificazione di 80 proteine associate al ribosoma umano, solo 34 sono presenti in altri eucarioti o procarioti. Mentre sono state proposte funzioni generali alle proteine associate al ribosoma, come la stabilizzazione del complesso e la regolazione della traduzione, alcune sono state anche attribuite alla modifica co-traslazionale delle proteine appena sintetizzate (recensito in ).
Elongazione
In contrasto con le fasi di inizio, terminazione e riciclaggio del ribosoma della traduzione, i meccanismi che guidano l’elongazione sono altamente conservati tra eucarioti e batteri (recensito in ).
Riconoscimento dei codoni
L’allungamento avviene in diverse fasi ben definite, a partire dal riconoscimento dei codoni dell’mRNA da parte dei loro corrispondenti aminoacil-tRNA. L’associazione con l’mRNA avviene attraverso il sito A ribosomiale ed è influenzata da vari fattori di allungamento. Per esempio, la GTPasi eEF1A consegna gli aminoacil-tRNA al sito A dopo essere stata attivata da eEF1B, un fattore di scambio nucleotide guanina (GEF) che accelera la dissociazione del GDP da eEF1A.
Formazione del legame peptidico
Dopo il riconoscimento del codone dell’mRNA, si crea un legame peptidico tra l’aminoacil-tRNA e il peptidil-tRNA (che si trova nel sito ribosomiale P). Questa reazione è facilitata dalla peptidil transferasi, che di per sé non è una proteina, ma un RNA ribosomiale altamente conservato. Il meccanismo di formazione del legame peptidico coinvolge cambiamenti conformazionali nel sito attivo piuttosto che la catalisi chimica da parte dei gruppi ribosomiali ed è guidato da un cambiamento di entropia favorevole.
Traslocazione dell’mRNA e dei tRNA attraverso il ribosoma
Una volta formato il legame peptidico, il sito A si libera quando il peptidil-tRNA che lo occupa si sposta nel sito P della grande subunità ribosomiale, sostituendo contemporaneamente un tRNA deacilato esistente che si sposta nel sito E prima di uscire dal ribosoma. Man mano che la catena aminoacidica cresce, e i siti A e P sono occupati transitoriamente da nuovi tRNA aminoacilici e peptidilici rispettivamente, si verifica una traslocazione dell’mRNA attraverso il ribosoma.
Due meccanismi, caratterizzati da cambiamenti conformazionali nelle subunità ribosomiali, facilitano la traslocazione di mRNA e tRNA. Questi sono noti come “ratcheting” e “swiveling”.
Il ratcheting si osserva in tutte le fasi della traduzione, e vede la piccola subunità ribosomiale subire una leggera rotazione, di circa ~8° rispetto alla grande subunità (rivista in ). Questo è distinto dallo swiveling che coinvolge un movimento del dominio della testa (30S) della piccola subunità. È importante notare che lo swiveling gioca un ruolo nell’attività elicasica intrinseca del ribosoma, che è importante per lo svolgimento delle strutture secondarie dell’mRNA.
Questi meccanismi garantiscono in definitiva che il tRNA si muova in modo sequenziale (da A-site a P-site a E-site) e permettono la formazione degli stati intermedi che sono noti per esistere durante la traslocazione di mRNA-tRNA. Questi stati, noti anche come stati ibridi, possono essere descritti utilizzando il modello eucariotico come esempio. Qui, le estremità 3′ del tRNA che occupano i siti A e P si spostano per occupare i siti P ed E nella subunità 60S, mentre le estremità 5′, che sono associate all’mRNA, rimangono ancorate rispettivamente ai siti A e P della subunità 40S.
Questi stati ibridi sono momentaneamente stabilizzati dal legame di eEF2-GTP (EF-G – GTP nei procarioti) al sito A ribosomiale. L’idrolisi del GTP però, che è mediata dall’attività GTPasi dell’EF-G o dell’omologo eucariotico eEF2, permette al meccanismo di ratcheting di continuare, e causa lo spostamento dell’mRNA e delle estremità 5′ del tRNA dai siti A e P nei siti P ed E rispettivamente. Una volta ripristinata la conformazione canonica A/A, P/P, E/E (60S/40S), l’EF-G – GDP si dissocia dal ribosoma, lasciando il sito A aperto per ricevere una nuova molecola di aminoacil-tRNA.
L’idrolisi del GTP da parte di EF-G / eEF2, e la successiva rotazione del dominio della testa assiste ulteriormente nella traslocazione del tRNA, impedendo qualsiasi movimento spontaneo all’indietro del tRNA.
Inizio della traduzione
Il primo passo della traduzione è noto come iniziazione. Qui, le unità ribosomiali grandi (60S) e piccole (40S) sono assemblate in un ribosoma 80S completamente funzionale. Questo è posizionato al codone di inizio (AUG) del filamento di mRNA da tradurre (rivisto in ).
L’iniziazione è considerata la fase limitante del processo globale ed è principalmente regolata e coordinata da un gruppo di proteine note come fattori di iniziazione eucariotici (eIF). Questi fattori variano in dimensioni e complessità, dalla singola subunità eIF1 da 113kDa al complesso eIF3 da 700kDa. Negli esseri umani, almeno 12 eIF funzionano di concerto per regolare l’iniziazione, ciascuno con un ruolo distinto, che è stato ampiamente rivisto in .
L’iniziazione inizia con la formazione di un complesso ternario che comprende eIF2, GTP e il tRNA iniziatore (Met-tRNAi). Il ruolo principale del complesso ternario è quello di consegnare l’iniziatore alla subunità 40S che successivamente stabilisce un complesso 43S, chiamato anche PIC (complesso di preiniziazione). Con l’assistenza di eIF4G ed eIF3, il PIC si lega al o vicino al 5′-termine dell’mRNA. Questo è segnato da un tappo di 7-metilguanosina (m7-G-cap). Una volta legata, la PIC scansiona la regione non tradotta 5′ per localizzare il codone di iniziazione.
La sequenza leader del 5′-terminale è mantenuta in uno stato non avvolto dall’attività elicasica di diversi eIF (inclusi eIF4F, eIF4G, eIF4A, eIF4B, eIF3). Una volta che la subunità 40S è posizionata al codone di iniziazione, la subunità 60S viene reclutata per formare un ribosoma 80S compatibile con l’elongazione. A questo punto il codone di inizio dell’mRNA è localizzato nel sito ribosomiale P, e l’intero complesso di iniziazione è pronto per entrare nella fase di elongazione.
È importante notare che la subunità 40S può legarsi all’mRNA indipendentemente dal m7-G-cap. L’esempio più importante di questo, che si ritiene si verifichi nel 5-10% degli mRNA cellulari, coinvolge la subunità 40S che si lega a un sito interno di ingresso del ribosoma (IRES). Altri percorsi di iniziazione indipendenti da m7-G-cap includono shunting, tethering, enhancer di traduzione, un elemento TISU e un leader poli-adenilato nel 5′-terminale.
Riciclaggio del ribosoma
La fase finale della traduzione è il riciclaggio del ribosoma, che vede il ribosoma dividersi nelle sue parti di subunità più piccole e preparare un altro ciclo di traduzione. Negli eucarioti questo significa che il ribosoma 80S si divide nelle sue subunità 40S e 60S. Anche se questo passo segna il completamento del processo di traduzione, può anche avvenire per una varietà di altre ragioni, tra cui quando la sintesi della catena polipeptidica fallisce, quando si incontra un mRNA danneggiato, o in seguito all’assemblaggio di ribosomi vuoti. Inoltre, questo passo è spesso descritto come l’inizio dell’iniziazione, con la proteina chiave che facilita la scissione dei ribosomi, associandosi anche con diversi fattori di iniziazione (ABCE1 ha dimostrato di associarsi con eIF2, eIF3 e eIF5 in modelli di lievito).
Negli eucarioti, il riciclaggio dei ribosomi è principalmente facilitato da ABCE1 (Rli1 nel lievito), che è un membro della superfamiglia ABC delle ATPasi. Questa proteina, che possiede due domini di legame nucleotidico e un dominio unico del cluster FeS1, si lega al complesso post-terminazione una volta che l’RF3-GDP si è dissociato dal ribosoma. Questa associazione si forma attraverso l’interazione tra il cluster FeS ed eRF1. È importante notare che ACBE1 contiene anche numerosi siti di legame che permettono interazioni tra le subunità ribosomiali e varie proteine ribosomiali. Per esempio, un motivo HLH nel primo dominio di legame del nucleotide ha dimostrato di legarsi all’rRNA 18S e all’rpS24-A. Anche se il meccanismo esatto che guida la scissione ribosomiale rimane poco chiaro, è stato proposto che negli eucarioti, è il risultato di un cambiamento conformazionale in ABCE1 che è indotto dall’idrolisi di ATP.
Come menzionato in precedenza, il rilascio del peptide non è un prerequisito per la dissociazione delle subunità ribosomiali o per il legame di ABCE1. Questo è importante quando il riciclaggio dei ribosomi è indotto in risposta al danno dell’mRNA o all’assemblaggio di ribosomi vacanti, poiché nessun codone di stop sarà rilevato per avviare la terminazione e il rilascio del peptide. Per superare questo, ABCE1 è in grado di facilitare il rilascio del peptide in modo simile al complesso ternario eRF1-eRF3-GTP, e questo ha dimostrato di avvenire indipendentemente dall’idrolisi di ATP. Qui, l’idrolisi di ATP induce un cambiamento conformazionale in eRF1 che promuove l’idrolisi del peptidil-tRNA.
Importante, eRF1 ed eRF3 possono essere sufficienti per avviare la dissociazione delle subunità; tuttavia questo avviene ad un ritmo più lento.
I meccanismi di riciclaggio nei procarioti sono distinti da quelli degli eucarioti, e la differenza principale è la presenza di un fattore specializzato di riciclaggio dei ribosomi (RRF) che agisce insieme a EF-G per separare le subunità ribosomiali nei batteri
Cessazione della traduzione
Il passo successivo nel processo di traduzione è la terminazione. In questa fase un codone di stop dell’mRNA indica che non devono essere aggiunti altri aminoacidi alla proteina in crescita. La terminazione negli eucarioti è facilitata solo da due fattori (eRF1 e eRF3) e differisce significativamente dal processo nei procarioti, che coinvolge tre fattori (RF1, RF2 e RF3). Negli eucarioti, devono verificarsi due processi distinti affinché l’allungamento del peptide sia terminato con successo; il rilascio del peptide e la costituzione del complesso post-terminazione. In alcuni casi, in cui la traduzione deve terminare prima del rilevamento di un codone di stop, la fase di terminazione può essere saltata e il riciclaggio del ribosoma iniziato in anticipo. In questo caso, il rilascio del peptide sarà facilitato da ABCE1.
La terminazione è attivata dall’ingresso di un codone di stop (UAA, UGA o UAG) nel sito A ribosomiale. Questo codone è riconosciuto da un fattore di rilascio di classe 1 (RF1). Negli eucarioti, questo fattore (eRF1) si lega al ribosoma come parte di un complesso ternario pre-assemblato che comprende eRF1, eRF3 e GTP. Lo stop-codon è riconosciuto da un motivo conservato situato all’estremità amino-terminale della proteina, come il motivo NIKS .
eRF1 assiste anche nell’idrolisi del peptidil-tRNA e nel rilascio del peptide dal centro della peptidil transferasi (PTC). Questo avviene come risultato dell’idrolisi del GTP da parte di eRF3, che induce un cambiamento conformazionale in eRF1 che permette al suo motivo Gly-Gly-Gln (GGQ), che si trova nel dominio “medio” (M), di entrare nel PTC ribosomiale e facilitare l’idrolisi del peptidyl-tRNA. Questo meccanismo differisce nei procarioti, dove il rilascio del peptide è richiesto per, e quindi precede, l’idrolisi del GTP da parte di RF3 .
Dopo l’idrolisi del GTP e il rilascio del peptide, il RF3-GDP si dissocia dalla proteina, lasciandosi dietro RF1, che rimane legato al ribosoma in quello che è noto come il complesso post-terminazione. Questo essenzialmente innesca il ribosoma per il riciclaggio ribosomiale.