5.5.9 Il ciclo degli acidi tricarbossilici
Il piruvato è al punto di diramazione della sequenza catabolica del metabolismo ossidativo del glucosio nel ciclo TCA e della via gluconeogenica dai precursori C3. In entrambe le vie, il piruvato entra nel ciclo TCA dove viene ossidativamente decarbossilato ad acetil-CoA tramite la piruvato deidrogenasi o carbossilato ad ossalacetato nella reazione della piruvato carbossilasi. Poiché la PC e la PDH sono in competizione per il piruvato, sono in posizioni chiave per la regolazione del metabolismo anaplerotico (cioè di rifornimento) e ossidativo, rispettivamente. Cohen e colleghi (1979b; Cohen, 1983, 1987a,b,c) hanno usato combinazioni di alanina o piruvato etichettati e non etichettati ed etanolo per studiare la competizione epatica dei substrati per l’ingresso nel ciclo TCA in vari stati ormonali e dietetici di fegati perfusi di ratto e topo.
Quando l’alanina era l’unico substrato epatico, C2, C3 e C4 di glutammato e glutammina sono stati prontamente marcati come previsto dalla topologia del ciclo TCA (Cohen et al, 1979b; Cohen, 1987a). L’alanina viene transaminata a piruvato, che viene decarbossilato ad acetil-CoA o carbossilato ad ossalacetato. L’acetil-CoA è incorporato in citrato e successivamente in α-chetoglutarato, che, a sua volta, può essere transaminata a glutammato. D’altra parte, l’ossalacetato è in equilibrio con il malato e il fumarato (vedi sezione 5.5.8) e l’etichetta è rimescolata in C2 e C3 dell’ossalacetato. La condensazione di tali isotopomeri dell’ossalacetato con l’acetil-CoA nella reazione della citrato sintasi dà successivamente origine a – e α-chetoglutarato e quindi a – e glutammato. La proporzione relativa di piruvato che entra nel ciclo TCA attraverso PC e PDH può quindi essere stimata dagli arricchimenti relativi in glutammato C2 e C4. Sotto l’ipotesi di un modello di primo ordine in cui si considera solo un giro del ciclo TCA e si trascura il riciclo continuo dell’etichetta (vedi sezione 5.3.7), Cohen (1983, 1987c) ha calcolato rapporti di PC rispetto al tasso di flusso PDH che variavano da 1,2 a 2,6 e 7,7 nei fegati di ratti donatori ben nutriti, diabetici e con 24 ore di digiuno, rispettivamente. Nel fegato diabetico, la proporzione relativa di piruvato incanalato nel ciclo TCA attraverso le due vie alternative non è stata alterata dall’incubazione in vitro con l’insulina.
In contrasto con gli esperimenti in cui l’alanina era l’unico substrato per il metabolismo epatico, la coadiuvazione di etanolo non etichettato ha prodotto glutammato C4 e glutammina C4 essenzialmente privo di etichetta (Cohen et al., 1979b). L’etanolo, che è prontamente ossidato dall’alcol deidrogenasi ad acetaldeide e poi ulteriormente ad acetato, serve come fonte aggiuntiva di acetil-CoA. I risultati hanno indicato che l’acetil-CoA derivato dall’etanolo compete efficacemente con l’acetil-CoA che entra nel ciclo TCA tramite PDH. Così, in presenza di una fonte alternativa di acetil-CoA, l’alanina è entrata nel ciclo TCA quasi esclusivamente attraverso la reazione PC. Inoltre, il cosupply dell’alanina con l’etanolo ha aumentato il tasso di consumo dell’alanina attraverso la reazione del PC di quasi 50% rispetto ai fegati perfusi con l’alanina da solo. Questo risultato non è inaspettato alla luce di una reazione PC che è regolata dal livello di acetil-CoA. Una concentrazione elevata di acetil-CoA, come era disponibile dal metabolismo dell’etanolo, ha aumentato il flusso attraverso la PC per allargare il pool di ossalacetato per un consumo accelerato di acetil-CoA nel ciclo TCA. Esperimenti simili con piruvato marcato + NH4C1 ed etanolo come substrati sono stati eseguiti e hanno fornito risultati equivalenti (Cohen, 1987a,b). Inoltre, Nedelec et al. (1990b) hanno usato il modello proposto da Cohen (1983) per valutare l’effetto della leucemia mieloproliferativa indotta dal virus sul metabolismo epatico. Il metabolismo dell’alanina nei fegati infetti di donatori a digiuno è stato trovato simile ai controlli alimentati. I fegati di entrambi i gruppi avevano un contributo ridotto di PC rispetto a PDH al flusso di alanina nel ciclo TCA rispetto ai controlli a digiuno. Il rapporto alterato del flusso PC/PDH nei fegati leucemici a digiuno è stato spiegato dalla disponibilità drasticamente ridotta di trigliceridi e quindi acetil-CoA in questi organi.
13C MRS offre la possibilità unica di seguire il metabolismo di etanolo e alanina contemporaneamente (vedi Figura 8). In esperimenti in cui l’alanina e l’etanolo sono stati usati come fonti di carbonio, è stato prodotto acetil-CoA con due diversi modelli di etichettatura (Cohen, 1987b). All’ingresso dell’alanina nel ciclo TCA attraverso la reazione PDH, si forma l’acetil-CoA e l’acetil-CoA deriva dall’etanolo. Oltre ad etichettare il citrato, l’α-chetoglutarato, il glutammato e la glutammina nelle posizioni C4 e C5, l’incorporazione dell’acetil-CoA dà origine ai tipici accoppiamenti di spin tra i carboni vicini C4 e C5 del glutammato e della glutammina, che sono facilmente distinguibili dalle risonanze di singoletto generate dall’incorporazione dell’alanina. Quindi, una stima diretta della competizione tra alanina ed etanolo può essere ottenuta dall’analisi del rapporto singoletto-multiplo in C4 del glutammato. L’analisi dei modelli di spin-coupling è stato utile anche per l’assegnazione di risonanze da glutatione osservato in 13C MR spettri ottenuti da fegati perfusi (Cohen, 1987a). I modelli di spin-coupling rilevati per la parte glutamilica nel glutatione su perfusione del fegato con precursori marcati 13C corrispondeva strettamente al modello di etichettatura osservato nel glutammato. Così, si è concluso che lo scheletro di carbonio del glutammato è rimasto intatto ed è stato direttamente incorporato nel glutatione sintetizzato de novo. Gli spostamenti chimici misurati negli estratti PCA dei fegati hanno indicato che il glutatione è presente nella sua forma ridotta.
Oltre al glutammato, l’etichettatura della glutammina epatica è stata osservata in molti esperimenti. Questo non è sorprendente perché la glutammina si forma facilmente nella reazione della glutammina sintasi. Cohen et al. (1979b) hanno seguito il corso del tempo dell’incorporazione dell’etichetta nel glutammato epatico e nella glutammina in fegati di topo perfusi in presenza di alanina ed etanolo etichettato o non etichettato. In tutte le condizioni indagate, l’arricchimento in glutammina in ritardo rispetto a quello di glutammato come evidenziato dal rapporto C4/C2 delle intensità del segnale 13C MR in glutammato e glutammina, rispettivamente. Il rapporto C4/C2 osservato nella glutammina in un dato momento non era lo stesso del rapporto corrispondente nel glutammato ma rifletteva invece il rapporto del glutammato di circa 1 ora prima. Questa differenza di tempo è stata usata come misura del flusso attraverso la reazione della glutammina sintasi controllata allostericamente in vivo. Risultati simili sono stati ottenuti da fegati di ratto perfusi con acetato (Desmoulin et al., 1985; Canioni et al., 1985). Tuttavia, l’interpretazione dell’etichettatura in glutammato e glutammina è stata portata un passo avanti. Gli autori hanno suggerito che il glutammato e la glutammina potrebbero prendere parte a un ciclo futile, che comprende le attività della glutammina sintasi citosolica, della glutaminasi mitocondriale e dello scambio glutammato/glutammina attraverso le membrane mitocondriali.
Nei fegati a digiuno perfusi con alanina ed etanolo o piruvato, cloruro di ammonio ed etanolo, si possono osservare aspartato e N-carbamoilaspartato marcati a C2 e C3 (Cohen, 1987a). Il rilevamento di aspartato etichettato non è inaspettato perché si forma facilmente dalla transaminazione dell’ossalacetato intermedio del ciclo TCA. L’N-carbamoilaspartato, tuttavia, è prodotto nel fegato in uno dei primi passi della sintesi de novo dei nucleotidi pirimidinici. L’N-carbamoilaspartato incorpora la parte intatta dell’aspartato, portando così al modello di etichettatura osservato. L’ulteriore rilevamento dell’etichetta 13C nei prodotti finali del percorso, come l’uridina e i suoi prodotti di fosforilazione, indica che una sintesi netta di N-carbamoilaspartato, al contrario del turnover, è stata osservata nei fegati perfusi (Cohen, 1987a).