5.5.9 El Ciclo del Ácido Tricarboxílico
El piruvato se encuentra en el punto de bifurcación de la secuencia catabólica del metabolismo oxidativo de la glucosa en el ciclo TCA y en la vía gluconeogénica a partir de precursores C3. En ambas vías, el piruvato entra en el ciclo del TCA donde es descarboxilado oxidativamente a acetil-CoA a través de la piruvato deshidrogenasa o carboxilado a oxaloacetato en la reacción de la piruvato carboxilasa. Dado que la PC y la PDH compiten por el piruvato, están en posiciones clave para la regulación del metabolismo anaplerótico (es decir, de reposición) y oxidativo, respectivamente. Cohen y colaboradores (1979b; Cohen, 1983, 1987a,b,c) utilizaron combinaciones de alanina o piruvato etiquetados y no etiquetados, y etanol para investigar la competencia de sustratos hepáticos para la entrada en el ciclo del TCA bajo diversos estados hormonales y dietéticos de hígados perfundidos de rata y ratón.
Cuando la alanina era el único sustrato hepático, los C2, C3 y C4 de glutamato y glutamina se marcaban fácilmente como se esperaba de la topología del ciclo del TCA (Cohen et al., 1979b; Cohen, 1987a). La alanina se transamina a piruvato, que se descarboxila a acetil-CoA o se carboxila a oxaloacetato. El acetil-CoA se incorpora a citrato y posteriormente a α-cetoglutarato, que, a su vez, puede transaminarse a glutamato. Por otro lado, el oxaloacetato está en equilibrio con el malato y el fumarato (véase el apartado 5.5.8) y la etiqueta se mezcla en C2 y C3 del oxaloacetato. La condensación de dichos isotopómeros de oxaloacetato con acetil-CoA en la reacción de la citrato sintasa da lugar posteriormente a – y α-cetoglutarato y, por tanto, a – y glutamato. La proporción relativa de piruvato que entra en el ciclo TCA a través de la PC y la PDH puede, por tanto, estimarse por los enriquecimientos relativos en glutamato C2 y C4. Bajo el supuesto de un modelo de primer orden en el que sólo se considera un giro del ciclo del TCA y se desprecia el reciclaje continuo de la etiqueta (véase la sección 5.3.7), Cohen (1983, 1987c) calculó ratios de tasa de flujo de PC frente a la PDH que oscilaban entre 1,2 y 2,6 y 7,7 en hígados de ratas bien alimentadas, diabéticas y donantes con ayuno de 24 horas, respectivamente. En el hígado diabético, la proporción relativa de piruvato canalizado hacia el ciclo del TCA a través de las dos vías alternativas no se vio alterada por la incubación in vitro con insulina.
En contraste con los experimentos en los que la alanina era el único sustrato para el metabolismo hepático, la coadición de etanol no etiquetado dio como resultado glutamato C4 y glutamina C4 esencialmente desprovistos de etiqueta (Cohen et al., 1979b). El etanol, que es fácilmente oxidado por la alcohol deshidrogenasa a acetaldehído y luego a acetato, sirve como fuente adicional de acetil-CoA. Los resultados indicaron que el acetil-CoA derivado del etanol compite eficazmente con el acetil-CoA que entra en el ciclo TCA a través de la PDH. Así, en presencia de una fuente alternativa de acetil-CoA, la alanina entraba en el ciclo del TCA casi exclusivamente a través de la reacción de la PC. Además, el co-suministro de alanina con etanol aumentó la tasa de consumo de alanina a través de la reacción PC en casi un 50% en comparación con los hígados perfundidos con alanina sola. Este resultado no es inesperado a la luz de una reacción de PC que está regulada por el nivel de acetil-CoA. Una concentración elevada de acetil-CoA, como la disponible en el metabolismo del etanol, aumentó el flujo a través de la PC para ampliar la reserva de oxaloacetato para un consumo acelerado de acetil-CoA en el ciclo del TCA. Se realizaron experimentos similares con piruvato etiquetado + NH4C1 y etanol como sustratos y proporcionaron resultados equivalentes (Cohen, 1987a,b). Además, Nedelec et al. (1990b) utilizaron el modelo propuesto por Cohen (1983) para evaluar el efecto de la leucemia mieloproliferativa inducida por el virus en el metabolismo hepático. Se comprobó que el metabolismo de la alanina en hígados infectados de donantes en ayunas era similar al de los controles alimentados. Los hígados de ambos grupos tenían una contribución reducida de la PC frente a la PDH al flujo de alanina en el ciclo TCA en comparación con los controles en ayunas. La relación alterada del flujo de PC/PDH en los hígados leucémicos en ayunas se explica por la drástica reducción de la disponibilidad de triglicéridos y, por tanto, de acetil-CoA en estos órganos.
13C MRS ofrece la posibilidad única de seguir el metabolismo del etanol y la alanina simultáneamente (véase la figura 8). En experimentos en los que se utilizaron alanina y etanol como fuentes de carbono, se produjo acetil-CoA con dos patrones de etiquetado diferentes (Cohen, 1987b). Al entrar la alanina en el ciclo del TCA a través de la reacción de la PDH, se forma acetil-CoA y se deriva acetil-CoA del etanol. Además de marcar el citrato, el α-cetoglutarato, el glutamato y la glutamina en las posiciones C4 y C5, la incorporación de acetil-CoA da lugar a los típicos acoplamientos de espín entre los carbonos vecinos C4 y C5 del glutamato y la glutamina, que se distinguen fácilmente de las resonancias singlete generadas por la incorporación de la alanina. Por lo tanto, se puede obtener una estimación directa de la competencia entre la alanina y el etanol a partir del análisis de la relación singlete-multiplete en el C4 del glutamato. El análisis de los patrones de acoplamiento de espín también fue útil para la asignación de las resonancias del glutatión observadas en los espectros de RMN de 13C obtenidos de hígados perfundidos (Cohen, 1987a). Los patrones de acoplamiento de espín detectados para la fracción de glutamilo en el glutatión tras la perfusión del hígado con precursores marcados con 13C se correspondían estrechamente con el patrón de etiquetado observado en el glutamato. Por lo tanto, se concluyó que el esqueleto de carbono del glutamato permaneció intacto y se incorporó directamente al glutatión sintetizado de novo. Los desplazamientos químicos medidos en los extractos de PCA de los hígados indicaron que el glutatión está presente en su forma reducida.
Aparte del glutamato, se observó el etiquetado de la glutamina hepática en muchos experimentos. Esto no es sorprendente porque la glutamina se forma fácilmente en la reacción de la glutamina sintasa. Cohen et al. (1979b) siguieron el curso temporal de la incorporación de la etiqueta en el glutamato y la glutamina hepáticos en hígados de ratón perfundidos en presencia de alanina y etanol marcado o sin marcar. En todas las condiciones investigadas, el enriquecimiento de la glutamina fue menor que el del glutamato, como lo demuestra la relación C4/C2 de las intensidades de la señal de RMN del 13C en el glutamato y la glutamina, respectivamente. La relación C4/C2 observada en la glutamina en un momento dado no era la misma que la relación correspondiente en el glutamato, sino que reflejaba la relación del glutamato de aproximadamente 1 hora antes. Esta diferencia temporal se utilizó como medida del flujo a través de la reacción de la glutamina sintasa controlada alostéricamente in vivo. Se obtuvieron resultados similares en hígados de rata perfundidos con acetato (Desmoulin et al., 1985; Canioni et al., 1985). Sin embargo, la interpretación del etiquetado en glutamato y glutamina se llevó a cabo un paso más allá. Los autores sugirieron que el glutamato y la glutamina podrían participar en un ciclo fútil, que comprende las actividades de la glutamina sintasa citosólica, la glutaminasa mitocondrial y el intercambio de glutamato/glutamina a través de las membranas mitocondriales.
En hígados en ayunas perfundidos con alanina y etanol o piruvato, cloruro de amonio y etanol, se pudo observar aspartato y N-carbamoilaspartato marcado en C2 y C3 (Cohen, 1987a). La detección de aspartato marcado no es inesperada porque se forma fácilmente por la transaminación del intermedio del ciclo TCA oxaloacetato. El N-carbamoilaspartato, sin embargo, se produce en el hígado en uno de los primeros pasos de la síntesis de novo de los nucleótidos de pirimidina. El N-carbamoilaspartato incorpora la fracción de aspartato intacta, lo que da lugar al patrón de etiquetado observado. La detección posterior de la etiqueta 13C en los productos finales de la vía, como la uridina y sus productos de fosforilación, indica que en los hígados perfundidos se observó una síntesis neta de N-carbamoilaspartato, a diferencia del recambio (Cohen, 1987a).