Fluorescencja jest jednym z najważniejszych i najbardziej użytecznych narzędzi w przyborniku biologa. W biologii prawie każda dziedzina, od fizjologii po immunologię, wykorzystuje cząsteczki fluorescencyjne (aka fluorofory) do wykrywania białek. Jednak konkretne nauki stojące za tym, jak działa fluorescencja, mogą być mylące lub przeoczone.
Nie lękajcie się! W tym artykule przedstawiamy kluczowe punkty fluorescencji, abyś mógł zostać ekspertem, którym zawsze chciałeś być.
Czym dokładnie JEST fluorescencja?
Z definicji, fluorescencja jest rodzajem fotoluminescencji, czyli tym, co dzieje się, gdy cząsteczka jest wzbudzona przez fotony światła ultrafioletowego lub widzialnego. Dokładniej, fluorescencja jest wynikiem pochłaniania przez cząsteczkę światła o określonej długości fali i emitowania światła o większej długości fali.
Details, Please
Na szczęście, temu tematowi dr Aleksander Jabłoński poświęcił swoje życie. Ostatecznie opracował on diagram Jabłońskiego, aby opisać absorpcję i emisję światła. W skrócie, 3 etapy fluorescencji to absorpcja (lub wzbudzenie), przejście nieradiacyjne (lub czas życia stanu wzbudzonego) i emisja fluorescencji.1
Rysunek 1. Diagram Jablonskiego. S0 i S1 reprezentują różne stany elektronowe. Pozostałe liczby (tu 0-3) reprezentują stany wibracyjne. Dzięki uprzejmości Jacobkhed.
Krok 1: Ekscytacja
Powrót do chemii ogólnej: światło widzialne istnieje jako cząstki elementarne zwane fotonami. Cząstki te są istotnymi pakietami energii, które po zaabsorbowaniu będą napędzać lub „wzbudzać” cząsteczkę pochłaniającą światło do wyższego poziomu energetycznego. W przypadku fluorescencji, fluorofory absorbują światło widzialne, zwykle dostarczane z lampy żarowej lub lasera, prowadząc do wzbudzonego elektronowego stanu singletowego (S1) cząsteczki.
Krok 2: Czas życia stanu wzbudzonego
Jak wszyscy wiemy, celem atomu jest bycie w stanie o najniższej energii, jak to tylko możliwe. Więc kiedy fluorofor jest wzbudzony do wyższego stanu elektronowego, natychmiast chce zacząć uwalniać energię; dlatego ten stan wzbudzony, znany jako czas życia stanu wzbudzonego, nie trwa zbyt długo (typowo 1-10 nanosekund). Mimo to, ten etap procesu jest niezwykle ważny, ponieważ to właśnie w tym czasie energia z S1 zaczyna się rozpadać w kierunku „zrelaksowanego” singletowego stanu wzbudzonego, z którego pochodzi emisja fluorescencji.
Krok 3: Emisja
Wreszcie, jesteśmy gotowi na fluorescencję! Zaczynając od „zrelaksowanego” stanu wzbudzonego, wysokoenergetyczny foton szybko rozpada się w kierunku stanu podstawowego i emituje nadmiar energii w postaci fotonu światła. To przejście energii nazywamy fluorescencją. Co ciekawe, ponieważ część tej energii została już uwolniona podczas życia w stanie wzbudzonym, energia fluoryzującego fotonu jest niższa niż energia fotonu wzbudzającego. Tak więc energia uwolniona podczas fluorescencji zawsze będzie miała większą długość fali niż ta potrzebna do wzbudzenia.
Jak cytometria przepływowa wykorzystuje cząsteczki fluorescencyjne?
Objęliśmy koncepcję i podstawy cytometrii przepływowej we wcześniejszych artykułach i seminarium internetowym, więc wróć i odśwież temat, jeśli potrzebujesz.
Gotowy? Zaczynajmy!
Przy pracy z cząsteczkami fluorescencyjnymi musimy zwrócić szczególną uwagę na różnicę między długością fali wzbudzenia i emisji lub energią, inaczej zwaną przesunięciem Stokesa. Znaczenie przesunięcia Stokesa leży w jego prostocie: pozwala nam ono określić, czy długość fali światła emitowanego i długość fali światła wzbudzającego są wystarczająco duże, aby je wiarygodnie rozróżnić. Ponieważ odczyt cytometrii przepływowej opiera się wyłącznie na fluorescencji, trzeba być świadomym tego parametru lub ryzykować wygenerowanie niewiarygodnych danych emoji kupy.
Co więcej, niezwykle ważne jest śledzenie widma absorpcji i widma emisji dla każdego fluoroforu oraz tego, jak różne lasery mogą oddziaływać z danym fluoroforem. Na przykład, w maszynie do cytometrii przepływowej laser jonów argonu emituje światło o długości fali 488 nm, które wzbudza fluorofor, izotiocyjanian fluoresceiny (FITC). Ponieważ długość fali 488-nm jest bardzo bliska maksimum absorpcji FITC, wzbudzenie powoduje wysoką emisję FITC. Jednakże, jeśli FITC zostanie wzbudzony inną długością fali z innego lasera w swoim spektrum absorpcji, emituje światło w tym samym spektrum, ale nie o tej samej intensywności.
I tak oto mamy: szybkie wprowadzenie/przypomnienie fluorescencji i jej związku z cząsteczkami fluorescencyjnymi wykorzystywanymi w cytometrii przepływowej. Pytania? Komentarze? Daj nam znać!