Fluorescência é uma das ferramentas mais importantes e úteis na caixa de ferramentas de um biólogo. Em biologia, quase todos os campos, da fisiologia à imunologia, usam moléculas fluorescentes (também conhecidas como fluoróforos) para detectar proteínas. No entanto, a ciência específica por trás de como a fluorescência funciona pode ser confusa ou ignorada.
Não tenha medo! Neste artigo, quebramos pontos-chave da fluorescência para que você possa ser o especialista que sempre quis ser.
O que é exactamente a fluorescência?
Por definição, a fluorescência é um tipo de fotoluminescência, que é o que acontece quando uma molécula é excitada por fotões de luz ultravioleta ou visível. Mais especificamente, a fluorescência é o resultado de uma molécula absorvendo luz num comprimento de onda específico e emitindo luz num comprimento de onda maior.
Details, Please
Felizmente, este tópico é aquilo a que o Dr. Aleksander Jablonski dedicou a sua vida. Ele eventualmente desenvolveu o diagrama Jablonski para descrever a absorção e emissão de luz. Em resumo, os 3 passos da fluorescência são absorção (ou excitação), transição não-radiativa (ou duração do estado excitado) e emissão de fluorescência.1
Figure 1. Diagrama Jablonski. S0 e S1 representam diferentes estados eletrônicos. Os outros números (aqui 0-3) representam estados vibracionais. Cortesia de Jacobkhed.
Passo 1: Excitação
Flashback to General Chemistry: a luz visível existe como partículas elementares chamadas fótons. Estas partículas são pacotes essenciais de energia que, quando absorvidas, irão impulsionar ou “excitar” a molécula que absorve a luz para um nível de energia mais elevado. No caso de fluorescência, os fluoróforos absorvem a luz visível, geralmente fornecida por uma lâmpada incandescente ou laser, levando a um estado de excitação electrónica de singlet (S1) da molécula.
Passo 2: Tempo de vida em estado excitado
Como todos sabemos, o objectivo de um átomo é estar no estado de menor energia possível. Assim, quando um fluoróforo está excitado a um estado electrónico superior, quer imediatamente começar a libertar energia; assim, este estado excitado, conhecido como o estado excitado vitalício, não dura muito tempo (tipicamente 1-10 nanossegundos). Mesmo assim, este passo no processo é incrivelmente importante, já que é durante este tempo que a energia de S1 começa a decair em direção a um estado “relaxado” de excitação singlet do qual se origina a emissão de fluorescência.
Passo 3: Emissão
E finalmente, estamos prontos para alguma fluorescência! Começando pelo estado “relaxado” de excitação, o fotão de alta energia decompõe-se rapidamente em direcção ao estado de terra e emite este excesso de energia como um fotão de luz. Esta transição de energia é o que conhecemos como fluorescência. Curiosamente, porque parte dessa energia já foi liberada durante a vida em estado excitado, a energia do fóton agora fluorescente é inferior à energia do fóton de excitação. Assim, a energia liberada durante a fluorescência será sempre de um comprimento de onda maior do que a necessária para a excitação.
Como a Citometria de Fluxo Tira Vantagem das Moléculas Fluorescentes?
Cobrimos o conceito e as bases da citometria de fluxo em artigos anteriores e num webinar, por isso volte atrás e refresque-se no tópico se precisar.
Pronto? Vamos!
Quando lidamos com moléculas fluorescentes, precisamos prestar atenção especial à diferença entre os comprimentos de onda de excitação e emissão ou energia, também conhecida como o deslocamento de Stokes. O significado do deslocamento de Stokes reside na sua simplicidade: permite-nos determinar se o comprimento de onda da luz emitida e o comprimento de onda da luz de excitação é suficientemente grande para os distinguir de forma fiável. Como a leitura da citometria de fluxo é baseada apenas na fluorescência, é essencial estar ciente deste parâmetro, ou correr o risco de gerar dados de emoji de cocô não confiáveis.
Além disso, é extremamente importante acompanhar o espectro de absorção e o espectro de emissão para cada fluoróforo, e como vários lasers podem interagir com o fluoróforo em questão. Por exemplo, em uma máquina de citometria de fluxo o laser de íon argônio emite 488-nm de luz, o que excita o fluoróforo, isotiocianato de fluoresceína (FITC). Como o 488-nm está muito próximo do máximo de absorção de FITC, a excitação resulta em alta emissão de FITC. Entretanto, se o FITC é excitado por outro comprimento de onda de um laser diferente dentro de seu espectro de absorção, ele emite luz no mesmo espectro, mas não é da mesma intensidade.
E aí você tem: uma rápida introdução/remoção da fluorescência e como ela se relaciona com as moléculas fluorescentes utilizadas na citometria de fluxo. Dúvidas? Comentários? Diga-nos!