Fluorescența este unul dintre cele mai importante și mai utile instrumente din setul de instrumente al biologului. În biologie, aproape fiecare domeniu, de la fiziologie la imunologie, utilizează molecule fluorescente (cunoscute și ca fluorofori) pentru a detecta proteinele. Cu toate acestea, știința specifică din spatele modului în care funcționează fluorescența poate fi confuză sau trecută cu vederea.
Nu vă temeți! În acest articol, defalcăm punctele cheie ale fluorescenței, astfel încât să puteți deveni expertul care v-ați dorit întotdeauna să fiți.
Ce este mai exact fluorescența?
Prin definiție, fluorescența este un tip de fotoluminescență, care este ceea ce se întâmplă atunci când o moleculă este excitată de fotoni de lumină ultravioletă sau vizibilă. Mai exact, fluorescența este rezultatul absorbției de către o moleculă a luminii la o anumită lungime de undă și a emiterii de lumină la o lungime de undă mai mare.
Detalii, vă rog
Din fericire, acest subiect este cel căruia Dr. Aleksander Jablonski și-a dedicat viața. El a dezvoltat în cele din urmă diagrama Jablonski pentru a descrie absorbția și emisia de lumină. Pe scurt, cei 3 pași ai fluorescenței sunt absorbția (sau excitarea), tranziția non-radiativă (sau durata de viață a stării excitate) și emisia de fluorescență.1
Figura 1. Diagrama Jablonski. S0 și S1 reprezintă stări electronice diferite. Celelalte numere (aici 0-3) reprezintă stări vibraționale. Prin amabilitatea lui Jacobkhed.
Etapa 1: Excitarea
Flashback la Chimie generală: Lumina vizibilă există sub formă de particule elementare numite fotoni. Aceste particule sunt pachete esențiale de energie care, atunci când sunt absorbite, vor propulsa sau „excita” molecula care absoarbe lumina la un nivel energetic superior. În cazul fluorescenței, fluoroforii absorb lumina vizibilă, de obicei furnizată de o lampă cu incandescență sau de un laser, ceea ce duce la o stare electronică excitată de tip singlet (S1) a moleculei.
Etapa 2: Durata de viață a stării excitate
După cum știm cu toții, scopul unui atom este să se afle în cea mai mică stare energetică posibilă. Astfel, atunci când un fluorofor este excitat într-o stare electronică superioară, acesta dorește imediat să înceapă să elibereze energie; astfel, această stare excitată, cunoscută sub numele de durata de viață a stării excitate, nu durează foarte mult timp (de obicei, 1-10 nanosecunde). Chiar și așa, această etapă a procesului este incredibil de importantă, deoarece în acest timp energia din S1 începe să scadă spre o stare excitată singlet „relaxată” din care provine emisia de fluorescență.
Etapa 3: Emisia
Și, în sfârșit, suntem gata pentru fluorescență! Pornind de la starea excitată „relaxată”, fotonul de mare energie se dezintegrează rapid spre starea fundamentală și emite acest exces de energie sub forma unui foton de lumină. Această tranziție de energie este ceea ce cunoaștem drept fluorescență. Interesant este faptul că, deoarece o parte din această energie a fost deja eliberată în timpul ciclului de viață al stării excitate, energia fotonului acum fluorescent este mai mică decât energia fotonului de excitație. Astfel, energia eliberată în timpul fluorescenței va avea întotdeauna o lungime de undă mai mare decât cea necesară pentru excitare.
Cum profită citometria în flux de moleculele fluorescente?
Am acoperit conceptul și elementele de bază ale citometriei în flux în articole anterioare și într-un webinar, așa că reveniți și reîmprospătați subiectul dacă aveți nevoie.
Pregătiți? Să mergem!
Când avem de-a face cu molecule fluorescente, trebuie să acordăm o atenție deosebită diferenței dintre lungimea de undă sau energia de excitație și cea de emisie, cunoscută și sub numele de deplasarea Stokes. Semnificația deplasării Stokes constă în simplitatea sa: ne permite să determinăm dacă lungimea de undă a luminii emise și lungimea de undă a luminii de excitație sunt suficient de mari pentru a le deosebi în mod fiabil. Deoarece citirea citometriei în flux se bazează exclusiv pe fluorescență, este esențial să fim conștienți de acest parametru, altfel riscăm să generăm date nefiabile, de tip poop emoji.
În plus, este extrem de important să urmărim spectrul de absorbție și spectrul de emisie pentru fiecare fluorofor, precum și modul în care diverse lasere pot interacționa cu fluoroforul în cauză. De exemplu, într-un aparat de citometrie de flux, laserul cu ioni de argon emite o lumină de 488 nm, care excită fluoroforul, izotiocianat de fluoresceină (FITC). Deoarece 488-nm este foarte aproape de maximul de absorbție al FITC, excitarea are ca rezultat o emisie mare de FITC. Cu toate acestea, dacă FITC este excitat de o altă lungime de undă de la un laser diferit în cadrul spectrului său de absorbție, acesta emite lumină în același spectru, dar nu este de aceeași intensitate.
Și iată: o scurtă introducere/reamintire a fluorescenței și a modului în care aceasta se referă la moleculele fluorescente utilizate în citometria de flux. Întrebări? Comentarii? Anunțați-ne!