5.5.9 Tricarboxylsyracykeln
Pyruvat befinner sig vid förgreningen av den katabola sekvensen av oxidativ glukosmetabolism i TCA-cykeln och den glukoneogena vägen från C3-prekursorer. I båda vägarna går pyruvat in i TCA-cykeln där det antingen oxidativt dekarboxyleras till acetyl-CoA via pyruvatdehydrogenas eller karboxyleras till oxaloacetat i pyruvatkarboxylasreaktionen. Eftersom PC och PDH konkurrerar om pyruvat har de nyckelpositioner för regleringen av den anaplerotiska (dvs. påfyllande) respektive oxidativa metabolismen. Cohen och medarbetare (1979b; Cohen, 1983, 1987a,b,c) använde kombinationer av märkt och omärkt alanin eller pyruvat och etanol för att undersöka hepatisk substratkonkurrens för inträde i TCA-cykeln under olika hormon- och diettillstånd i perfunderad rått- och muslever.
När alanin var det enda hepatiska substratet märktes C2, C3 och C4 av glutamat och glutamin lätt som förväntat utifrån TCA-cykelns topologi (Cohen et al, 1979b; Cohen, 1987a). Alanin transamineras till pyruvat, som antingen dekarboxyleras till acetyl-CoA eller karboxyleras till oxaloacetat. Acetyl-CoA införlivas i citrat och därefter i α-ketoglutarat, som i sin tur kan transamineras till glutamat. Å andra sidan befinner sig oxaloacetat i jämvikt med malat och fumarat (se avsnitt 5.5.8) och märkningen förvrängs till C2 och C3 i oxaloacetat. Kondensation av sådana oxaloacetatisotopomerer med acetyl-CoA i citratsyntasreaktionen ger därefter upphov till – och α-ketoglutarat och därmed till – och glutamat. Den relativa andelen pyruvat som går in i TCA-cykeln via PC och PDH kan därför uppskattas genom den relativa anrikningen i glutamat C2 och C4. Under antagandet av en modell av första ordningen där endast ett varv i TCA-cykeln beaktas och kontinuerlig återvinning av märkning försummas (se avsnitt 5.3.7), beräknade Cohen (1983, 1987c) förhållandet mellan PC- och PDH-flödeshastigheten som varierade från 1,2 till 2,6 och 7,7 i lever från välnärda, diabetiska och 24-timmarsfasta donatorråttor, respektive. I diabetisk lever förändrades inte den relativa andelen pyruvat som kanaliseras in i TCA-cykeln genom de två alternativa vägarna av in vitro-inkubationen med insulin.
I motsats till experiment där alanin var det enda substratet för hepatisk metabolism resulterade samtidig tillsats av omärkt etanol i glutamat C4 och glutamin C4 som i stort sett saknade märkning (Cohen et al., 1979b). Etanol, som lätt oxideras av alkoholdehydrogenas till acetaldehyd och sedan vidare till acetat, tjänar som ytterligare en källa för acetyl-CoA. Resultaten visade att acetyl-CoA som härrör från etanol effektivt konkurrerar med acetyl-CoA som kommer in i TCA-cykeln via PDH. I närvaro av en alternativ källa till acetyl-CoA gick således alanin in i TCA-cykeln nästan uteslutande via PC-reaktionen. Dessutom ökade samförsörjningen av alanin med etanol alaninkonsumtionen via PC-reaktionen med nästan 50 % jämfört med lever som perfunderades med enbart alanin. Detta resultat är inte oväntat med tanke på att PC-reaktionen regleras av nivån av acetyl-CoA. En förhöjd koncentration av acetyl-CoA, som fanns tillgänglig vid etanolmetabolism, ökade flödet genom PC för att öka oxaloacetatpoolen för en snabbare förbrukning av acetyl-CoA i TCA-cykeln. Liknande experiment med märkt pyruvat + NH4C1 och etanol som substrat utfördes och gav likvärdiga resultat (Cohen, 1987a,b). Vidare använde Nedelec et al. (1990b) den modell som Cohen (1983) föreslog för att bedöma effekten av virusinducerad myeloproliferativ leukemi på levermetabolismen. Alaninmetabolismen i infekterad lever hos fastande donatorer visade sig likna den hos kontrollpersoner som fått mat. Levern i båda grupperna hade ett minskat bidrag från PC jämfört med PDH till flödet av alanin i TCA-cykeln jämfört med fastande kontroller. Det förändrade förhållandet mellan PC/PDH-flödet i leukemisk fastande lever förklarades av den drastiskt minskade tillgången på triglycerider och därmed acetyl-CoA i dessa organ.
13C MRS erbjuder den unika möjligheten att följa metabolismen av etanol och alanin samtidigt (se figur 8). I experiment där alanin och etanol användes som kolkällor producerades acetyl-CoA med två olika märkningsmönster (Cohen, 1987b). När alanin går in i TCA-cykeln via PDH-reaktionen bildas acetyl-CoA och acetyl-CoA härrör från etanol. Förutom att citrat, α-ketoglutarat, glutamat och glutamin märks i positionerna C4 och C5 ger inkorporeringen av acetyl-CoA upphov till typiska spinkopplingar mellan de angränsande kolvätena C4 och C5 i glutamat och glutamin, som lätt kan särskiljas från de singulettresonanser som genereras av inkorporeringen av alanin. En direkt uppskattning av konkurrensen mellan alanin och etanol kan därför erhållas från analysen av förhållandet mellan singlet och multiplet i C4 av glutamat. Analysen av spin-kopplingsmönster var också användbar för tilldelningen av resonanser från glutathion som observerats i 13C MR-spektra som erhållits från perfunderad lever (Cohen, 1987a). De spinkopplingsmönster som upptäcktes för glutamyldelen i glutathion vid leverperfusion med 13C-märkta prekursorer överensstämde nära med det märkningsmönster som observerades i glutamat. Därför drogs slutsatsen att kolskelettet i glutamat förblev intakt och införlivades direkt i de novo-syntetiserad glutation. Kemiska skift som uppmättes i PCA-extrakt från lever visade att glutation finns i reducerad form.
Som glutamat observerades märkning av hepatiskt glutamin i många experiment. Detta är inte förvånande eftersom glutamin lätt bildas i glutaminsyntasreaktionen. Cohen et al. (1979b) följde tidsförloppet för märkningens inkorporering i hepatisk glutamat och glutamin i muslever som perfunderades i närvaro av alanin och märkt eller omärkt etanol. Under alla undersökta förhållanden var anrikningen av glutamin efter den av glutamat, vilket framgår av förhållandet C4/C2 mellan 13C MR-signalernas intensitet i glutamat respektive glutamin. Förhållandet C4/C2 som observerades i glutamin vid varje given tidpunkt var inte detsamma som motsvarande förhållande i glutamat utan återspeglade istället glutamatförhållandet ungefär en timme tidigare. Denna tidsskillnad användes som ett mått på flödet genom den allosteriskt kontrollerade glutaminsyntasreaktionen in vivo. Liknande resultat har erhållits från råttlever som perfunderats med acetat (Desmoulin et al., 1985; Canioni et al., 1985). Tolkningen av märkningen i glutamat och glutamin gjordes dock ett steg längre. Författarna föreslog att glutamat och glutamin skulle kunna delta i en futilcykel, som omfattar aktiviteterna hos cytosoliskt glutaminsyntas, mitokondriellt glutaminas och glutamat/glutaminutbyte genom mitokondrialmembranen.
I fastande lever som perfunderats med alanin och etanol eller pyruvat, ammoniumklorid och etanol kunde aspartat och N-carbamoylaspartat märkta vid C2 och C3 observeras (Cohen, 1987a). Det är inte oväntat att märkt aspartat upptäcks eftersom det lätt bildas genom transaminering av TCA-cykelintermediären oxaloacetat. N-karbamoylaspartat produceras dock i levern i ett av de första stegen i de novo pyrimidinnukleotidsyntesen. N-karbamoylaspartat innehåller den intakta aspartatdelen, vilket leder till det observerade märkningsmönstret. Den fortsatta upptäckten av 13C-märkning i slutprodukterna av vägen, såsom uridin och dess fosforyleringsprodukter, indikerar att en nettosyntes av N-karbamoylaspartat, i motsats till omsättning, observerades i perfunderad lever (Cohen, 1987a).