Re-epitelizace: postupující hranice epitelu při hojení ran

Úvod

Kůže dospělých se skládá ze tří vrstev: epidermis a dermis oddělených bazální membránou. Když dojde k hlubokému poranění, které zničí část dermis, musí být rychle opravena, aby se obnovila ochranná bariéra . Hojení ran in vivo je složitý reparační proces řízený intra- a intercelulárními cestami. Aby se obnovila integrita kůže, probíhá tento proces ve čtyřech po sobě jdoucích, ale překrývajících se fázích: srážení, zánět, reepitelizace a remodelace. Bezprostředně po poranění se vytvoří sraženina složená převážně z fibrinových vláken a krevních destiček, která ucpe ránu (fáze 1). Následně během následujících 2-10 dnů (fáze 2) je sraženina průběžně infiltrována zánětlivými buňkami, které odstraňují zbytky a uvolňují chemické faktory, jako je vaskulární endoteliální růstový faktor a transformující růstový faktor beta. Jakmile se vytvoří chemický gradient, začnou se rekrutovat různé buňky, aby vytvořily novou tkáň (fáze 3). Na jedné straně se v dermis rekrutuje neovaskulatura a fibroblasty (ukládající kolagen), které reformují sraženinu do granulační tkáně, jež výživně a fyzicky podporuje opravu horních vrstev. Na druhé straně keratinocyty migrují a proliferují na okraji rány, aby rozšířily nově vytvořený epiteliální koberec tvořený několika vrstvami buněk v epidermis. Tento proces se nazývá reepitelizace a trvá dva až tři týdny. Na konci třetí fáze se myofibroblasty přeměněné z fibroblastů smršťují a snaží se okraj rány spojit. Zanikají apoptózou v dermis. Remodelace (stadium 4) pokračuje měsíce nebo i roky, aby se obnovila homoeostáza normální kůže. Normální anatomická struktura se však skutečně neobnoví a z granulační tkáně se vytvoří jizva. Zatímco u dospělých lidí to platí pro velké rány, u lidských embryí se mohou dokonale uzavřít, přičemž důvody nejsou zcela objasněny. Zajímavé je, že se předpokládá, že tvorba jizvy je evoluční obětí za účelem dosažení rychlého uzavření rány, což naznačuje intenzivní a nadbytečná zánětlivá reakce, která zprostředkovává systematické chování buněk během reepitelizace uvolňováním chemických signálů. Ve všech případech je konečná jizva výsledkem vzájemného působení buněk a mikroprostředí prostřednictvím fyzikálních a chemických faktorů během čtyř fází.

Zaměřujeme se zde na reepitelizaci, kdy se keratinocyty, převládající epidermální buňky, oddělují od bazální membrány, migrují k okraji rány a proliferují, poháněny morfogeny v granulační tkáni . Velmi pečlivé experimenty s migrací epitelu in vitro byly nedávno provedeny několika skupinami . Jsou realizovány na pevném podkladu a zahrnují postupující monovrstvu motivovanou kolektivním chováním buněk prostřednictvím migrace, generování sil a reorganizace buněčného cytoskeletu na okraji. Zjištění naznačují neintuitivní způsob, jakým buňky dosahují robustnosti během opravy, kdy se zdá, že chemotaxe není rozhodující pro globální migraci buněk in vitro. Nicméně díky hojným morfogenním signálům uvolňovaným v ráně in vivo ve srovnání s experimenty in vitro chemotaxe dominuje kolektivnímu chování buněk během procesu hojení rány. Blíže k hojení rány in vivo (obrázek 1a(i)(ii)) byla rekonstituována umělá rohovka (obrázek 1b(i)(ii)) zavedením epiteliálních buněk, fibroblastů a růstových faktorů do trojrozměrné Petriho misky. Je zajímavé, že všechny tyto práce se týkají kruhové geometrie spíše než lineárního řezu provedeného v dřívějších experimentech . Ačkoli jsou tyto systémy dobře kontrolované, není jasné, zda představují celou složitost hojení ran in vivo . Nicméně jak experimenty in vivo, tak in vitro prezentují neuspořádaný vývoj hranic, což naznačuje možnou univerzální nepravidelnost způsobenou chemotaxí (obrázek 1).

V této práci popisujeme reepitelizaci uvažováním kruhového otvoru ve tkáni, přičemž adaptujeme nedávný dynamický model chemotaktické migrace řízené morfogenetickými gradienty. Protože je model spojitý, popisuje tkáň v měřítku větším, než je velikost buněk, ale menším, než je velikost otvoru. Zde nerozlišujeme druhy buněk ani kategorie chemoatraktantů. Ten je kontinuálně dodáván příchozím tokem ze třetí dimenze normální k epiteliální vrstvě a vychytáván buněčnými receptory. Jak je uvedeno v článku , tenkost pohybující se vrstvy transformuje trojrozměrný proces na dvourozměrný model, kde lokalizovaná změna tloušťky na hranici přispívá k napětí T. Kromě toho předpokládáme, že mezi pohybující se vrstvou a substrátem existuje silné viskózní tření , což umožňuje zapsat Darcyho zákon pro průměrné rychlostní pole uvnitř tkáně, zatímco interakce mezi buňkami a mitózou jsou transformovány na okrajové podmínky rozhraní v ostré hranici rozhraní. Nejprve představíme fyzikální model, poté analytické zpracování poskytující explicitní řešení pro kruhovou geometrii a studii jeho stability. V případě lineární hranice se totiž ukázalo, že při nízkých rychlostech dochází k nestabilitě s dlouhou vlnovou délkou v důsledku Goldstoneova módu (translační invariance), který samotné povrchové napětí nedokáže zakázat . Intuitivně lze očekávat, že u malých děr zmizí, protože se zvýrazní efekt povrchového napětí. Naopak, stejně jako v případě experimentů in vitro, mohou větší otvory vykazovat obrysovou nestabilitu vedoucí k dynamickému chování, které se snažíme předpovědět. Aby bylo možné jít nad rámec analýzy stability, vyžaduje časově závislý problém volných hranic numerické metody schopné řešit rovnice na vyvíjejících se doménách. Rozhodli jsme se řešit náš problém pomocí metod hladinových soustav, které poprvé vyvinul v 80. letech Osher & Sethian , které jsou schopny automaticky sledovat pohyblivá rozhraní a topologické změny a byly úspěšně aplikovány na problémy, jako jsou interakce kapaliny a plynu , zpracování obrazu a růst nádorů . Vzhledem k povaze našeho teoretického problému zvolíme metodiku vyvinutou pro růst nádorů . V následujícím textu nejprve představíme model a uvedeme nejdůležitější fyzikální parametry, poté analýzu pro slabou amplitudovou nestabilitu a nakonec numerické metody a simulace pro konečný stav uzávěru.

Model

Uvažujeme kruhový otvor Ω ve dvourozměrné buněčné populaci o hustotě ρ ponořené do morfogenetického prostředí (obrázek 2). Buňky migrují proti morfogennímu gradientu, přičemž chemotaktický tok je úměrný koncentračnímu gradientu morfogenů , přičemž Λc je konstanta mobility. Repartition morfogenů uvnitř a vně otvoru Ω je vyživována prostřednictvím zdrojů přicházejících zdola. Mitóza probíhá pouze na hranici a k uzavření dochází většinou migrací. Hmotnostní bilance pro populaci buněk je pak

2,1

Při zanedbání objemového růstu (γ = 0) ve tkáni s výjimkou periferie je hustota buněk konstantní a ρ = ρ0. Rovnice (2.1) se zjednodušuje na a dává, že normálová rychlost čela je přímo úměrná normálovému koncentračnímu gradientu. Při extrémně nízkých rychlostech splňuje migrace buněk Darcyho zákon , přičemž Mp je koeficient porozity rovný kvadrátu výšky epitelu dělenému koeficientem tření. Jak je uvedeno v , tento zákon je odvozen v tkáních, kdy tření mezi fázemi nebo tření se substrátem vyrovnává hydrostatickou část elastického napětí působícího na buňky. Rána narušuje homoeostatický stav okolí a zdroj morfogenů se bude snažit obnovit optimální rovnovážnou hodnotu v apertuře c0. Vezmeme-li tuto koncentraci jako jednotku pro koncentraci morfogenu (což dává ), τc dobu absorpce jako jednotku času, Le jako jednotku délky (s , De je koeficient difúze uvnitř epitelu), dostaneme

2,2

s indexem h nebo e odkazujícím na vnitřní (otvor) nebo vnější (epitel) oblast. δ = Dh/De představuje poměr mezi koeficientem difúze v díře Dh a ve tkáni De, je větší než 1 a α udává sílu příčného toku, který udržuje hladinu morfogenu uvnitř díry. Vzhledem k relativní pomalosti migrace buněk zanedbáváme v rovnici (2.2) závislost na čase. Vezmeme-li De/Mp jako jednotku tlaku, zjednodušíme Darcyho zákon na, kde pro zjednodušení ponecháme stejný zápis pro p a v. Z rovnice hmotnostní bilance (2.1) dostaneme následující Laplaceovu rovnici spojující neznámý tlak p s koncentrací chemoatraktantu c:

2.3

Tak dostáváme, kde ϕ je holomorfní funkce, která splňuje Δϕ = 0. Nakonec musíme věnovat zvláštní pozornost okrajovým podmínkám rozhraní. U rovnice (2.2) se týkají spojitosti koncentrace a nespojitosti toku v důsledku spotřeby morfogenu mitózou na hranici(ukázka viz ):

2,4

kde N je vnější normála. Γ2 je rychlost příjmu omezená na hranici diskutovaná níže spolu s rychlostmi mitózy Γ1 ana hranici. Kapilarita fixuje tlakový skok na rozhraní

2,5

což dává podmínku volné hranice s ohledem na geometrický efekt, kdeje lokální poloměr křivosti.se rovná poloměru, pokud je geometrií kružnice. Uvažuje však lokální efekt na malém délkovém měřítku, když je hranice narušena. Současně se rychlostrozhraní liší od rychlosti epitelu v v důsledku proliferace buněk na hranici a dostáváme

2.6

kde Γ1 je rychlost mitózy a σ počet kapilár vztažený k napětí T na rozhraní, takžeHojení rány in vivo dominuje dvourozměrná migrace a morfogeny pravděpodobně nejsou živiny, takže Γ2 mizí a Γ1c musí být nahrazen, pokud uvažujeme také mitózu bez kvantitativního vlivu koncentrací živin. Počet kapilár σ může zahrnovat činnost aktinového lanka (svazku mikrofilament) v buňkách. Během hojení embryonálních ran mohou buňky předního okraje globálně koordinovat své aktinové kabely, které vytvářejí efekt na makroskopické úrovni. V dospělosti se však toto koordinované chování ztrácí, takže účinek aktinových kabelů může působit pouze lokálně. To se podobá σ v našem modelu, který není účinný pro velké rány. Uvažování souboru rovnic (2.2) a (2.3) ve spojení se souborem okrajových podmínek (2.4), (2.5) a (2.6) ukazuje, že chemotaticky řízená migrace je skutečně volně ohraničený problém zahrnující několik parametrů, které reprezentují biologickou složitost, a studium jednoduchých případů, například kruhového uzávěru, může pomoci pochopit jejich odpovídající role. Uvádíme tedy nejprve analytické výsledky pro otvor, který zůstává po celou dobu kruhový, a poté jeho stabilitu.

Výsledky

3.1. Pravidelný kruhový uzávěr

V kvazistatické aproximaci lze rovnici (2.2) řešit analyticky a získat

3.1

I0 (resp. K0) je modifikovaná Besselova funkce nulového řádu, pravidelná při r = 0 (resp. r → ∞). Rovnice (3.1) zohledňuje spojitost na rozhraní, A je dána spojitostí toku a zní

3.2

s následující definicí pro(poměr dvou po sobě jdoucích Besselových funkcí) a ekvivalentní proTlak P0 uvnitř epitelu se stává

3,3

Pro stanovení neznámého stupně volnosti použijeme Laplaceův zákon. Holomorfní funkce ϕ, úměrná log(r), představuje možnou hnací sílu, která se objevuje na rozhraní (tj. tzv. kenotaxe definovaná v ). Skutečně, i v nepřítomnosti morfogenů je in vitro pozorována migrace epitelu na pevném podkladu, možná díky reorganizaci buněčného cytoskeletu na okraji rány. Všimněte si, že model zůstává platný, pokud chemotaxi zavrhneme za předpokladu, že se změní definice délkových a časových jednotek. Kromě toho jsou C0 a P0 závislé na čase prostřednictvím R(t). Pro zjednodušení vypustíme závislost na časeRychlostuzávěru odvozená z rovnice (3.5) je pak

3.4

Rychlost uzavírání je konstantní pro velké díry a je exponenciálně malá , když se poloměr R stane malým, pokud se omezíme na chemotatickou migraci a proliferaci. Poloměr velkého otvoru se tedy začíná lineárně zmenšovat v čase, ale úplné uzavření bude trvat nekonečně dlouho, než se ho dosáhne. U malých děr se chemotaxe stává subdominantní ve srovnání s kenotaxí Ain na rozhraní, které řídí dynamiku uzavření, a poloměr splňuje difuzní zákon v t1/2 . Obrázek 3 ukazuje jako funkci R pro různé hodnoty α, δ a Ain/Λ a §4 obsahuje diskusi parametrů.

3.2. Znázornění rychlosti. Ztráta kruhovitosti

Rovnice (3.4) však platí pouze v případě, že je zachován kruhový obrys. Proto provedeme lineární analýzu stability pro velké rány (Ain ∼ 0) za předpokladu malé harmonické poruchy pro poloměr jako vyvolávající změny tlaku P a koncentračního pole C stejného řádu ε takto:

3.5

kde index i označuje buď veličinu vztaženou k otvoru (h, 0 < r < R), nebo k epidermis (e, R < r < ∞). Ačkoli všechny perturbační veličiny závisí na zvoleném módu n, lineární perturbační analýza s těmito módy zachází nezávisle. Vypustíme tedy index n a vypočítáme perturbační koncentrační pole ci(r) z rovnice (2.3)

3.6

zatímco perturbované tlakové pole je dáno vztahem, kde bereme v úvahu harmonické módy holomorfní funkce ϕ s B fixovaným Laplaceovým zákonemDíky slabosti ε lze naši soustavu rovnic po linearizaci řešit analyticky a rychlost růstu módu n zní

3.7

kde

Rovnice (3.7) představuje implicitní vztah pro Ωn, který se řeší iteračními technikami, a kladné hodnoty označují módy odpovědné za destabilizaci kruhové hranice v průběhu migrace. Výsledky jsou uvedeny pro různé hodnoty Λ, α a δ, přičemž Ωn je zobrazeno na obrázku 4. Diskuse k parametrům je uvedena v § 4. Výsledky naznačují nestabilitu vedoucí k odchylce od kružnice v krátkém čase, a to pro n až do kritického módu nc (stanoveného kapilaritou). To je důvod, proč je nutné provést numerické simulace, aby bylo možné jít nad rámec lineární analýzy a plně zohlednit nelinearity.

3.3. Difúze mezi epitelem a ránou. Úplná dynamika a numerické metody

Diskretizujeme c v rovnici (2.2) a tlak p v rovnici (2.3) na kartézské síti v prostoru a implicitně v čase pomocí nelineární adaptivní Gaussovy-Seidelovy iterační metody . Na hranici domény zavedeme mizivé hodnoty c a normálový gradient p. Poté se přidá šum na C = c + χ s Počínaje dokonalou kružnicí s R = 90 se sleduje uzavírání rány metodou hladinových sad vyvinutou v článku, kde skalární funkce Φ s popisuje ránu (Φ < 0), epitel (Φ > 0) a rozhraní (Φ = 0). Normála a zakřivení v rovnici (2.5) jsou vypočteny pomocí standardní diferenciální geometrie: a Φ se aktualizuje vztahem , kde Vext je konstantní prodloužení Vint na rozhraní z rovnice (2.5) po gradientu Všimněte si, že tato metoda simuluje dokonalé kruhové uzavření bez šumu. Podle našich výsledků se rána brzy po růstu odchýlí od dokonalé kružnice, jak je znázorněno na obrázcích 5 a 6 a ve shodě s analýzou stability

Diskuse a závěr

V tomto modelu je několik nezávislých parametrů. Některé z nich můžeme zafixovat pomocí publikovaných experimentálních dat (tabulka 1). Naše jednotka rychlosti je kompatibilní s rychlostí uzavírání rohovky (3 dny pro otvor o poloměru přibližně 3 mm ), což dává Λ ∼ 1 pro tento experiment podle rovnice (3.2). Na obrázku 4 měníme parametry α a δ, které se obtížněji odhadují, a také Λ. Vzhledem k velké velikosti ran v praxi dává lineární analýza stability vždy nestabilitu a tento závěr je robustní vůči změnám parametrů. Tento závěr potvrzují i plně nelineární simulace ve stejném rozsahu parametrů (obrázky 5 a 6). V simulacích přispívá velké Λ (přibližně 10, celkový čas přibližně 60) k rychlejšímu uzavření ve srovnání s malým Λ (přibližně 1, celkový čas přibližně 600). Typický příklad procesu uzavírání s α = 1 a δ = 2 je znázorněn na obrázku 5a. Postupující rozhraní se při hojení rány zvlní; když se však rána zmenší, povrchové napětí opět stabilizuje ránu do tvaru brambory v souladu s analýzou lineární stability. Toto povrchové napětí může také rány štípat na menší kousky, jak je znázorněno na obrázku 5b(ii), obrázku 6 a v . Tento děj vyžaduje zpočátku nepravidelnější uzavření (červené šipky na obrázku 6), kdy je koncentrace chemoatraktantu méně homogenní vzhledem k nedostatečnému příčnému toku (α = 0,1). Ke štípnutí může dojít jak v mezistupni, tak na konci uzavírání (žluté šipky), což odpovídá pozorování v pozdní fázi hojení rány na monovrstvě buněk MDCK (obrázek 6, vpravo) a naznačuje stejné chování při složitějších procesech hojení rány.

V této práci jsme teoreticky ukázali, že reepitelizace rány dává hraniční nestabilitu při klinicky realistických parametrech. Náš model, poháněný chemotaxí, nezavádí další aktivity buněk, které ránu v konečné fázi uzavírají. Předpokládáme však, že tato chemotaktická nestabilita na okraji rány může ovlivnit kvalitu konečné opravy. Během embryonálního hojení rány, kdy je pozorována dokonalá rekonstrukce, je rána uzavřena „kabelkou“, která představuje koordinaci buněk předního okraje usnadněnou aktinovým kabelem . Tento mechanismus se ztrácí v dospělé kůži, kde se rána uzavírá plazením buněk (několik vrstev) po granulační tkáni . Ve srovnání se statickým substrátem in vitro dochází na konci reepitelizace granulační tkáně ke kontrakci myofibroblasty . Účelem je skutečně sblížení okraje, které připomíná „kabelkovou šňůru“, ale kontrakce těchto buněk musí být kompatibilní se synchronní konstitucí materiálu, což je mechanicky a systematicky náročné .

Na závěr diskutujeme náš model v kontextu hojení kožní rány in vivo. Jelikož rána zasahuje hluboko do dermis, což je případ většiny ran, obě vrstvy se během reepitelizace chovají odlišně. Hloubka rány přispívá k tloušťce ve spodní vrstvě, kde se uvolňuje chemoatraktant. Vezmeme-li v úvahu reepitelizaci, při níž se nad spodními vrstvami, kde se uvolňuje chemoatraktant, pohybuje pouze několik vrstev buněk, přispívá hloubka rány matematicky k síle příčného toku chemoatraktantu α. Kromě α, které může zahrnovat hloubku rány, se uvažuje geometrie, velikost rány a také poměr difuzního koeficientu δ. Ve srovnání s experimenty in vivo se může proces hojení lidských ran lišit od procesu hojení u pokusných myší v důsledku odlišných biomechanických vlastností kůže. Pokud však hodláme uvažovat o problému in vivo s přihlédnutím k bioelasticitě, problém nepředstavují pouze rozdílné složky obou vrstev, ale také skutečnost, že spojení mezi dermální a epidermální vrstvou je velmi neuspořádané i u neporušené kůže, jak ukázala naše předchozí práce. Pravidelný vzor by měl být definován ve třetím rozměru, který považujeme za „normální“. Rovněž vzhledem k tomu, že tkáň rány prochází během hojení remodelací, nelze mechanické parametry považovat za konstanty a relaxace tkáně se pravděpodobně vyvíjí ve větším časovém měřítku než reepitelizace. Tyto relaxační procesy by skutečně měly být brány v úvahu i při předpovídání kvality konečné opravy. Předtím by měla být jako složka zohledněna nepravidelnost okraje rány způsobená chemotaxí.

Vyjádření o financování

Tato práce byla částečně podpořena organizací AAP Physique Cancer 2012.

Poznámky

.