Re-epitelialisering: avancerad epitelgräns vid sårläkning

Introduktion

Vuxen hud består av tre lager: epidermis och dermis, åtskilda av basalmembranet. När en djup skada inträffar som förstör en del av dermis måste den snabbt lagas för att återställa den skyddande barriären . Sårläkning in vivo är en komplex reparationsprocess som styrs av intra- och intercellulära vägar. För att återställa hudens integritet genomförs denna process i fyra på varandra följande men överlappande faser: koagulering, inflammation, reepitelisering och remodellering. Omedelbart efter en skada bildas en koagel som huvudsakligen består av fibrinfibrer och trombocyter för att täppa till såret (steg 1). Under de följande 2-10 dagarna (steg 2) infiltreras koaglet kontinuerligt av inflammatoriska celler som rensar upp skräp och frisätter kemiska faktorer, t.ex. vaskulär endotelisk tillväxtfaktor och transformerande tillväxtfaktor-beta. När den kemiska gradienten väl är etablerad rekryteras olika celler för att bygga upp den nya vävnaden (steg 3). Å ena sidan rekryteras nya blodkärl och fibroblaster (som avlagrar kollagen) i dermis, vilket omvandlar proppen till en granulationsvävnad, som näringsmässigt och fysiskt stöder reparationen av de övre lagren. Å andra sidan migrerar och förökar sig keratinocyter vid kanten av såret för att utvidga den nybildade epitelmattan som består av flera lager celler i epidermis. Denna process kallas återepitelisering och pågår i två till tre veckor. I slutet av steg 3 drar myofibroblaster som omvandlats från fibroblaster ihop sig och försöker föra ihop sårkanten. De försvinner genom apoptos i dermis. Återuppbyggnaden (steg 4) fortsätter i månader eller till och med i åratal för att återställa homöostasen i den normala huden. Den normala anatomiska strukturen återställs dock inte riktigt och ett ärr bildas av granulationsvävnad. Detta gäller för stora sår hos vuxna människor, men sår hos mänskliga embryon kan stängas helt och hållet, och orsakerna till detta är inte helt klarlagda. Intressant nog tros ärrbildningen vara en evolutionär uppoffring för att uppnå snabb sårförslutning och detta indikeras av det intensiva och överflödiga inflammatoriska svaret som förmedlar de systematiska cellbeteendena under reepitelisering genom att släppa ut kemiska signaler. I alla fall är det slutliga ärret ett resultat av samspelet mellan cellerna och mikromiljön genom fysiska och kemiska faktorer under de fyra stegen.

Här fokuserar vi på reepitelisering när keratinocyter, de epidermala dominerande cellerna, lossnar från basalmembranet, migrerar mot sårgränsen och prolifererar, drivna av morfogena ämnen i granulationsvävnaden . Flera grupper har nyligen utfört mycket noggranna in vitro-experiment med epitelmigration. De genomförs på ett fast substrat och omfattar ett framskridande monolager som motiveras av cellernas kollektiva beteende genom migration, generering av krafter och omorganisering av cellcytoskelettet vid marginalen. Resultaten visar på ett icke-intuitivt sätt för cellerna att uppnå robusthet under reparationen, där kemotaxis inte verkar vara avgörande för den globala cellmigrationen in vitro. På grund av de rikliga morfogena signaler som frigörs i såret in vivo jämfört med in vitro-experiment dominerar dock kemotaxis cellernas kollektiva beteende under sårläkningsprocessen. Närmare sårläkning in vivo (figur 1a(i)(ii)) har en konstgjord hornhinna återskapats (figur 1b(i)(ii)) genom införande av epitelceller, fibroblaster och tillväxtfaktorer i en tredimensionell Petriskål. Intressant nog gäller alla dessa arbeten den cirkulära geometrin snarare än det linjära snittet som gjorts i tidigare experiment . Även om dessa system är välkontrollerade är det oklart om de representerar hela komplexiteten hos sårläkning in vivo . Trots detta uppvisar både in vivo- och in vitro-experiment en oordnad gränsutveckling, vilket tyder på en möjlig universell oregelbundenhet på grund av kemotaxis (figur 1).

I det här arbetet beskriver vi återepiteliseringen genom att betrakta ett cirkulärt hål i en vävnad, och anpassar en nyligen utvecklad dynamisk modell för kemotaktisk migration som drivs av morfogenetiska gradienter. Eftersom modellen är kontinuerlig beskriver den vävnaden på en skala som är större än cellstorleken men mindre än hålets storlek. Här skiljer vi inte på cellarter eller kategorier av kemoattraktiva ämnen. De senare tillförs kontinuerligt av ett inkommande flöde från den tredje dimensionen som är normal för epitelskiktet och tas upp av cellreceptorer. Som framgår av , omvandlar det rörliga skiktets tunnhet den tredimensionella processen till en tvådimensionell modell, där den lokaliserade tjockleksvariationen vid gränsen bidrar till en spänning T. Dessutom antar vi att det finns en stark viskös friktion mellan det rörliga skiktet och substratet , vilket gör det möjligt att skriva en Darcys lag för det genomsnittliga hastighetsfältet inne i vävnaden, medan cell-cellinteraktioner och mitos omvandlas till gränssnittsgränser i gränsen för skarpa gränssnitt. Vi presenterar först den fysiska modellen, sedan den analytiska behandlingen som ger en explicit lösning för den cirkulära geometrin och en studie av dess stabilitet. I fallet med en linjär gräns har det visat sig att en instabilitet med lång våglängd uppstår vid låga hastigheter på grund av ett Goldstoneläge (translationell invarians) som ytspänningen ensam inte kan förhindra . Intuitivt kan man förvänta sig att den försvinner för små hål när ytspänningseffekten accentueras. Tvärtom kan större hål, som i experiment in vitro, uppvisa instabila konturer som leder till dynamiska beteenden som vi försöker förutsäga. För att gå längre än stabilitetsanalysen kräver det tidsberoende problemet med fria gränser numeriska metoder som kan lösa ekvationer på områden som utvecklas. Vi väljer att angripa vårt problem med hjälp av level-set-metoder, som först utvecklades på 1980-talet av Osher & Sethian , som kan spåra rörliga gränsytor och topologiska förändringar automatiskt och som framgångsrikt har tillämpats på problem som växelverkan mellan vätska och gas, bildbehandling och tumörtillväxt. På grund av karaktären hos vårt teoretiska problem väljer vi den metod som utvecklats för tumörtillväxt . I det följande presenterar vi först modellen och introducerar de mest relevanta fysiska parametrarna, sedan analysen för instabilitet med svag amplitud och slutligen numeriska metoder och simuleringar för det slutliga tillståndet för stängningen.

Modellen

Vi betraktar ett cirkulärt hål Ω i en tvådimensionell cellpopulation med täthet ρ nedsänkt i en morfogenetisk miljö (figur 2). Cellerna migrerar uppåt i morfogengradienten, där det kemotaktiska flödet är proportionellt mot koncentrationsgradienten av morfogener , där Λc är en mobilitetskonstant. Morfogenfördelningen inom och utanför hålet Ω får näring från källor som kommer underifrån. Mitos sker endast vid gränsen och stängningen sker huvudsakligen genom migration. Massbalansen för cellpopulationen är då

2,1

Om man bortser från den volymetriska tillväxten (γ = 0) i vävnaden utom vid periferin är celltätheten konstant och ρ = ρ0. Ekvation (2.1) förenklas till och ger att frontens normalhastighet är direkt proportionell mot den normala koncentrationsgradienten. Vid extremt låga hastigheter uppfyller cellmigrationen en Darcys lag , där Mp är en porositetskoefficient som är lika med kvadraten på epitelhöjden dividerad med en friktionskoefficient. Som framgår av , härleds denna lag i vävnader när friktion mellan faser eller friktion mot ett substrat balanserar den hydrostatiska delen av den elastiska spänningen som verkar på cellerna . Såret stör det homöostatiska tillståndet i omgivningen och en källa till morfogener kommer att försöka återställa ett optimalt jämviktsvärde i öppningen c0. Om man tar denna koncentration som enhet för morfogenkoncentrationen (vilket ger ), τc upptagningstiden som tidsenheter, Le som längdenhet (med , De är diffusionskoefficienten inne i epitelet), får vi

2,2

med indexet h eller e som hänvisar till den inre (hålet) eller yttre (epitelet) domänen. δ = Dh/De representerar förhållandet mellan diffusionskoefficienten i hålet Dh och vävnaden De, det är större än 1, och α anger styrkan hos det tvärgående flödet som upprätthåller morfogennivån inne i hålet. På grund av cellmigrationens relativa långsamhet försummar vi tidsberoendet i ekvation (2.2). Om vi tar De/Mp som tryckenhet förenklas Darcys lag till, där vi för enkelhetens skull behåller samma notation för p och v. Från massbalansekvationen (2.1) får vi följande Laplaceekvation som kopplar det okända trycket p till den kemoattraktiva koncentrationen c:

2.3

Så får vi, där ϕ är en holomorf funktion som uppfyller Δϕ = 0. Slutligen måste vi ägna särskild uppmärksamhet åt gränssnittets randvillkor. För ekvation (2.2) gäller de koncentrationskontinuiteten och flödeskontinuiteten på grund av morfogenförbrukningen genom mitos vid gränsen

(för demonstration, se ):

2.4

varvid N är den yttre normalen. Γ2 är den upptagningshastighet som begränsas vid gränsen som diskuteras nedan tillsammans med mitoshastigheterna Γ1 ochvid gränsen. Kapillariteten fixerar trycksprånget vid gränssnittet

2,5

vilket ger det fria gränsvillkoret med hänsyn till den geometriska effekten därär den lokala krökningsradien.är lika med radien om geometrin är en cirkel. Det tar dock hänsyn till den lokala effekten på liten längdskala när gränsen störs. Samtidigt skiljer sig gränssnittetshastighetfrån epitelet v genom cellförökningen vid gränsen och vi får

2.6

där Γ1 är mitoshastigheten och σ kapillärantalet relaterat till spänningen T vid gränssnittet såSårläkning in vivo domineras av tvådimensionell migration och morfogenerna är troligen inte näringsämnena, så Γ2 försvinner och Γ1c måste ersättas medom vi också betraktar mitos utan den kvantitativa effekten av näringskoncentrationerna. Kapillärantalet σ kan involvera aktiviteterna i aktinkabeln (bundna mikrofilament) i cellerna. Under embryonal sårläkning kan de ledande kantcellerna samordna sina aktinkablar globalt vilket genererar en effekt på makroskopisk nivå. Detta samordnade beteende går dock förlorat hos vuxna, så effekten av aktinkablarna kan endast verka lokalt. Detta liknar σ i vår modell som inte är effektiv för stora sår. Om man betraktar ekvationsuppsättningen (2.2) och (2.3) tillsammans med uppsättningen randvillkor (2.4), (2.5) och (2.6) visar det sig att kemotatiskt driven migration verkligen är ett problem med fria gränser som involverar flera parametrar för att representera den biologiska komplexiteten, och studiet av enkla fall, till exempel den cirkulära stängningen, kan bidra till att förstå deras motsvarande roller. Vi presenterar därför först de analytiska resultaten för ett hål som alltid förblir cirkulärt och sedan dess stabilitet.

Resultaten

3.1. Regelbunden cirkulär stängning

I den kvasistatiska approximationen kan ekvation (2.2) lösas analytiskt och ger

3.1

I0 (resp. K0) som är den modifierade Bessel-funktionen av nollordning, regelbunden vid r = 0 (resp. r → ∞). Ekvation (3.1) tar hänsyn till kontinuiteten vid gränssnittet, A ges av flödeskontinuiteten och lyder

3.2

med följande definition för(kvoten mellan två på varandra följande Bessel-funktioner) och motsvarande förTrycket P0 inne i epitelet blir

3,3

Vi använder Laplace-lagen för att fastställa den okända frihetsgraden. Den holomorfa funktionen ϕ, som är proportionell mot log(r), representerar en möjlig drivkraft som uppträder vid gränssnittet (dvs. den så kallade kenotaxan som definieras i ). Faktum är att även i avsaknad av morfogener observeras in vitro epitelmigration på fast substrat, kanske på grund av omorganiseringen av det cellulära cytoskelettet vid sårgränsen. Observera att modellen förblir giltig om vi bortser från kemotaxis förutsatt att definitionen av längd- och tidsenheterna ändras. Dessutom är C0 och P0 beroende av tiden via R(t). För enkelhetens skull släpper vi tidsberoendet av

Hastighetenför förslutningen som härleds från ekvation (3.5) är då

3.4

Slutningshastigheten är konstant för stora hål och är exponentiellt liten när radien R blir liten, om man begränsar sig till kemotatisk migration och proliferation. Radien för ett stort hål börjar alltså med en linjär minskning med tiden, men den totala stängningen kommer att ta oändligt lång tid innan den är helt uppnådd. För små hål blir kemotaxis subdominant jämfört med kenotaxis Ain vid gränssnittet som kontrollerar stängningsdynamiken och radien uppfyller en diffusiv lag i t1/2 . Figur 3 visar som funktion av R för olika värden på α, δ och Ain/Λ och §4 innehåller en diskussion om parametrarna.

3.2. Förlust av cirkularitet

Ekvation (3.4) är dock giltig endast om den cirkulära konturen bibehålls. Därför utför vi en linjär stabilitetsanalys för stora sår (Ain ∼ 0) genom att anta en liten harmonisk störning för radien som orsakar variationer i trycket P och koncentrationsfältet C av samma ordning ε enligt följande:

3.5

där subscript i anger antingen en kvantitet i förhållande till hålet (h, 0 < r < R) eller till epidermis (e, R < r < ∞). Även om alla störningsmängder beror på det valda läget n behandlar den linjära störningsanalysen dessa lägen oberoende av varandra. Därför släpper vi indexet n och beräknar de störande koncentrationsfälten ci(r) från ekvation (2.3)

3.6

medan det störda tryckfältet ges avdär vi tar hänsyn till de harmoniska lägena för den holomorfa funktionen ϕ med B fixerad genom Laplace-lagenPå grund av ε:s svaghet kan vårt ekvationssystem, när det väl har blivit linjäriserat, lösas analytiskt och tillväxthastigheten för läget n lyder

3.7

varvid

Ekvation (3.7) representerar ett implicit förhållande för Ωn, som löses genom iterativa tekniker och positiva värden indikerar de lägen som är ansvariga för destabiliseringen av den cirkulära gränsen när migrationen fortskrider. Resultaten presenteras för olika värden på Λ, α och δ, där Ωn visas i figur 4. Se §4 för diskussionen om parametrarna. Resultaten visar på en instabilitet som leder till en avvikelse från en cirkel på kort tid, för n upp till ett kritiskt läge nc (fastställt av kapillariteten). Det är därför numeriska simuleringar är nödvändiga för att gå längre än den linjära analysen och fullt ut beakta olinjäriteterna.

3.3. Full dynamik och numeriska metoder

Vi diskretiserar c i ekvation (2.2) och trycket p i ekvation (2.3) på ett kartesiskt nät i rymden och implicit i tiden, med hjälp av en icke-linjär adaptiv Gauss-Seidel iterativ metod . Vid domängränsen ålägger vi både försvinnande värden för c och normal gradient för p. Sedan läggs bruset till på C = c + χ med Med utgångspunkt i en perfekt cirkel med R = 90 följs sårets stängning med hjälp av den level-set-metod som utvecklades i där en skalär funktion Φ med beskriver såret (Φ < 0), epitelet (Φ > 0) och gränssnittet (Φ = 0). Normalen och krökningen i ekvation (2.5) beräknas med hjälp av vanlig differentialgeometri: och Φ uppdateras med relationen , där Vext är den konstanta förlängningen av Vint på gränssnittet från ekvation (2.5) som följer gradienten Observera att denna metod simulerar en perfekt cirkulär stängning utan brus. Enligt våra resultat avviker såret från en perfekt cirkel strax efter tillväxten, vilket visas i figurerna 5 och 6 och stämmer överens med stabilitetsanalysen.

Diskussion och slutsats

Det finns flera oberoende parametrar i den här modellen. Vi kan fastställa några av dem med de publicerade experimentella uppgifterna (tabell 1). Vår hastighetsenhet är kompatibel med hornhinnans stängningshastighet (3 dagar för ett hål med en radie på cirka 3 mm ) vilket ger Λ ∼ 1 för detta experiment enligt ekvation (3.2). I figur 4 varierar vi parametrarna α och δ, som är svårare att uppskatta, samt Λ. På grund av den stora storleken på såren i praktiken ger den linjära stabilitetsanalysen alltid en instabilitet och denna slutsats är robust mot parameterförändringar. Denna slutsats bekräftas av helt icke-linjära simuleringar inom samma parameterområde (figurerna 5 och 6). I simuleringarna bidrar ett stort Λ (ca 10, total tid ca 60) till snabbare stängning jämfört med ett litet Λ (ca 1, total tid ca 600). Ett typiskt exempel på stängningsprocessen med α = 1 och δ = 2 visas i figur 5a. Det framskjutande gränssnittet blir vågigt när såret läker, men när såret blir litet åter stabiliserar ytspänningen såret till en potatisform som överensstämmer med den linjära stabilitetsanalysen. Ytspänningen kan också göra att såren kan klämmas av i mindre bitar, vilket visas i figur 5b(ii), figur 6 och i . Denna händelse kräver först en mer oregelbunden stängning (röda pilar i figur 6), när koncentrationen av kemoattraktiva ämnen är mindre homogen på grund av otillräckligt tvärgående flöde (α = 0,1). Avknäppningen kan ske både i det mellanliggande eller slutskedet av stängningen (gula pilar), vilket överensstämmer med observationer i det sena skedet av sårläkning på ett monolager av MDCK-celler (figur 6, till höger), vilket tyder på samma beteende i mer komplexa sårläkningsprocesser.

I det här arbetet har vi teoretiskt visat att sårreepitelisering ger en gränsinstabilitet under kliniskt realistiska parametrar. Driven av kemotaxis introducerar vår modell inte andra cellaktiviteter som stänger såret i slutskedet. Vi förmodar dock att denna kemotaktiska instabilitet vid gränsen av såret kan påverka kvaliteten på den slutliga reparationen. Under embryonal sårläkning, där en perfekt rekonstruktion observeras, stängs såret av ett ”snöre” som representerar en samordning av cellerna i den främre kanten som underlättas av aktinkabeln . Denna mekanism går förlorad i den vuxna huden, där såret stängs genom att cellerna (i flera lager) kryper på granulationsvävnaden . Jämfört med ett statiskt substrat in vitro genomgår granulationsvävnaden en kontraktion i slutet av återepiteliseringen av myofibroblaster . Detta syfte är faktiskt att föra samman kanten, vilket liknar ett ”snöre”, men sammandragningen av dessa celler måste vara förenlig med den synkrona materialkonstitutionen, vilket mekaniskt och systematiskt är en utmaning .

Slutningsvis diskuterar vi vår modell i samband med sårläkning av huden in vivo. Eftersom såret går djupt in i dermis, vilket är fallet för de flesta sår, beter sig de två lagren olika under reepiteliseringen. Djupet på ett sår bidrar till tjockleken i det undre skiktet där kemoattraktanten frigörs. Med tanke på återepiteliseringen där endast flera lager av celler blir rörliga ovanför de nedre lagren där kemoattraktanten frigörs, bidrar sårets djup matematiskt till den tvärgående kemoattraktantens flödesstyrka α. Förutom α, som kan innefatta sårets djup, beaktas geometrin, sårets storlek samt diffusionskoefficientförhållandet δ. Om man jämför med experiment in vivo kan sårläkningsprocessen hos människor skilja sig från den hos försöksmöss på grund av olika biomekaniska egenskaper hos huden. Om man avser att beakta problemet in vivo och ta hänsyn till bioelasticiteten, beror utmaningen inte bara på de två skiktens olika komponenter, utan också på det faktum att övergången mellan det dermala och epidermala skiktet är mycket oordnad även i intakt hud, vilket vi har visat i vårt tidigare arbete. Ett regelbundet mönster bör definieras i den tredje dimensionen som vi betraktar som ”normal”. Eftersom sårvävnaden genomgår en remodellering under läkningen kan de mekaniska parametrarna inte heller betraktas som konstanter, och vävnadens relaxation utvecklas troligen på en större tidsskala än återepiteliseringen. Dessa relaxationsprocesser bör också beaktas när man förutsäger kvaliteten på den slutliga reparationen. Dessförinnan bör oregelbundenheten i sårgränsen som drivs av kemotaxis betraktas som en ingrediens.

Finansiering

Detta arbete stöddes delvis av AAP Physique Cancer 2012.

Fotnoter