Ri-epitelizzazione: l’avanzamento dell’epitelio di frontiera durante la guarigione delle ferite

Introduzione

La pelle degli adulti è composta da tre strati: l’epidermide e il derma separati dalla membrana basale. Quando si verifica una lesione profonda che distrugge una parte del derma, deve essere riparata rapidamente per ripristinare la barriera protettiva. La guarigione delle ferite in vivo è un complesso processo di riparazione orchestrato da vie intra- e intercellulari. Per recuperare l’integrità della pelle, questo processo si compie attraverso quattro fasi successive ma sovrapposte: coagulazione, infiammazione, riepitelizzazione e rimodellamento. Immediatamente dopo una ferita, si forma un coagulo composto principalmente da fibre di fibrina e piastrine per tappare la ferita (fase 1). Successivamente, nei 2-10 giorni successivi (fase 2), il coagulo è continuamente infiltrato da cellule infiammatorie che ripuliscono i detriti e rilasciano fattori chimici, come il fattore di crescita endoteliale vascolare e il fattore di crescita-beta trasformante. Una volta stabilito il gradiente chimico, diverse cellule vengono reclutate per fabbricare il nuovo tessuto (fase 3). Da un lato, la neo-vasculatura e i fibroblasti (che depositano collagene) vengono reclutati nel derma, riformando il coagulo in un tessuto di granulazione, che sostiene nutrizionalmente e fisicamente la riparazione degli strati superiori. D’altra parte, i cheratinociti migrano e proliferano sul bordo della ferita per estendere il nuovo tappeto epiteliale formato da diversi strati di cellule nell’epidermide. Questo processo è chiamato riepitelizzazione e dura da due a tre settimane. Alla fine della fase 3, i miofibroblasti trasformati da fibroblasti si contraggono e cercano di riunire il bordo della ferita. Essi scompaiono per apoptosi nel derma. Il rimodellamento (stadio 4) continua per mesi o addirittura per anni al fine di ripristinare l’omeostasi della pelle normale. Tuttavia, la struttura anatomica normale non è veramente recuperata e si forma una cicatrice dal tessuto di granulazione. Mentre questo è vero per le grandi ferite negli esseri umani adulti, quelle negli embrioni umani possono essere perfettamente chiuse, le ragioni non sono del tutto comprese. È interessante notare che si ritiene che la formazione della cicatrice sia un sacrificio evolutivo per ottenere una rapida chiusura della ferita e questo è indicato dall’intensa e ridondante risposta infiammatoria che media i comportamenti sistematici delle cellule durante la riepitelizzazione attraverso il rilascio di segnali chimici. In tutti i casi, la cicatrice finale è il risultato dell’interazione tra le cellule e il microambiente attraverso fattori fisici e chimici durante le quattro fasi.

Qui ci concentriamo sulla riepitelizzazione quando i cheratinociti, le cellule epidermiche predominanti, si staccano dalla membrana basale, migrano verso il margine della ferita e proliferano, guidate dai morfogeni nel tessuto di granulazione. Esperimenti di migrazione dell’epitelio in vitro molto accurati sono stati eseguiti recentemente da diversi gruppi. Realizzati su un substrato solido, coinvolgono un monostrato che avanza motivato dal comportamento collettivo delle cellule attraverso la migrazione, la generazione di forze e la riorganizzazione del citoscheletro cellulare al margine. I risultati indicano un modo non intuitivo delle cellule di raggiungere la robustezza durante la riparazione dove la chemiotassi non sembra essere decisiva per la migrazione globale delle cellule in vitro. Tuttavia, a causa degli abbondanti segnali morfogenici rilasciati nella ferita in vivo rispetto agli esperimenti in vitro, la chemiotassi domina il comportamento collettivo delle cellule durante il processo di guarigione della ferita. Più vicino alla guarigione della ferita in vivo (figura 1a(i)(ii)), è stata ricostituita una cornea artificiale (figura 1b(i)(ii)) mediante l’introduzione di cellule epiteliali, fibroblasti e fattori di crescita in una piastra Petri tridimensionale. È interessante notare che tutti questi lavori riguardano la geometria circolare piuttosto che il taglio lineare fatto negli esperimenti precedenti. Anche se ben controllato, non è chiaro che questi sistemi presentano l’intera complessità della guarigione delle ferite in vivo. Tuttavia, sia gli esperimenti in vivo che quelli in vitro presentano un’evoluzione disordinata dei bordi, che indica una possibile irregolarità universale dovuta alla chemiotassi (figura 1).

In questo lavoro, descriviamo la riepitelizzazione considerando un foro circolare in un tessuto, adattando un recente modello dinamico di migrazione chemiotattica guidata da gradienti morfogenetici. Essendo continuo, il modello descrive il tessuto su una scala più grande della dimensione delle cellule ma più piccola della dimensione del foro. Qui, non distinguiamo le specie di cellule o le categorie di chemioattrattori. Quest’ultimo è continuamente fornito da un flusso in entrata dalla terza dimensione normale allo strato epiteliale e assorbito dai recettori cellulari. Come mostrato in , la sottigliezza dello strato mobile trasforma il processo tridimensionale in un modello bidimensionale, dove la variazione di spessore localizzata al confine contribuisce a una tensione T. Inoltre, assumiamo che esista un forte attrito viscoso tra lo strato mobile e il substrato, che permette di scrivere una legge di Darcy per il campo di velocità media all’interno del tessuto, mentre le interazioni cellula-cellula e la mitosi sono trasformate in condizioni al limite dell’interfaccia. Presentiamo prima il modello fisico, poi il trattamento analitico che fornisce una soluzione esplicita per la geometria circolare e uno studio della sua stabilità. In effetti, nel caso di un confine lineare, è stato dimostrato che un’instabilità di lunghezza d’onda lunga si verifica a basse velocità a causa di un modo Goldstone (invarianza traslazionale) che la tensione superficiale da sola non può riuscire a vietare. Intuitivamente, ci si può aspettare che essa scompaia per piccoli fori quando l’effetto della tensione superficiale si accentua. Al contrario, come per gli esperimenti in vitro, i fori più grandi possono esibire instabilità di contorno che portano a comportamenti dinamici che ci proponiamo di prevedere. Per andare oltre l’analisi di stabilità, il problema dei confini liberi dipendenti dal tempo richiede metodi numerici in grado di risolvere equazioni su domini in evoluzione. Abbiamo scelto di affrontare il nostro problema con i metodi level-set, sviluppati per la prima volta negli anni ’80 da Osher & Sethian, che sono in grado di seguire automaticamente le interfacce in movimento e i cambiamenti topologici e sono stati applicati con successo a problemi come le interazioni liquido-gas, l’elaborazione delle immagini e la crescita dei tumori. A causa della natura del nostro problema teorico, selezioniamo la metodologia sviluppata per la crescita tumorale. Di seguito, presentiamo prima il modello, introducendo i parametri fisici più rilevanti, poi l’analisi per l’instabilità di ampiezza debole, e infine i metodi numerici e le simulazioni per lo stato finale della chiusura.

Il modello

Si considera un foro circolare Ω in una popolazione cellulare bidimensionale di densità ρ immersa in un ambiente morfogenetico (figura 2). Le cellule migrano lungo il gradiente morfogenetico, il flusso chemiotattico è proporzionale al gradiente di concentrazione dei morfogeni , con Λc che è una costante di mobilità. La ripartizione dei morfogeni all’interno e all’esterno del foro Ω è alimentata da fonti provenienti dal basso. La mitosi avviene solo al confine e la chiusura è per lo più realizzata dalla migrazione. Il bilancio di massa per la popolazione cellulare è quindi

2.1

Negando la crescita volumetrica (γ = 0) nel tessuto tranne che alla periferia, la densità cellulare è costante e ρ = ρ0. L’equazione (2.1) si semplifica a e dà che la velocità normale del fronte è direttamente proporzionale al gradiente di concentrazione normale. A velocità estremamente basse, la migrazione cellulare soddisfa una legge di Darcy , essendo Mp un coefficiente di porosità uguale al quadrato dell’altezza dell’epitelio diviso per un coefficiente di attrito. Come mostrato in , questa legge è dedotta nei tessuti quando l’attrito tra le fasi o l’attrito con un substrato equilibra la parte idrostatica dello stress elastico che agisce sulle cellule. La ferita perturba lo stato omeostatico dell’ambiente circostante e una fonte di morfogeni cercherà di ripristinare un valore di equilibrio ottimale nell’apertura c0. Prendendo questa concentrazione come unità per la concentrazione del morfogeno (dando ), τc il tempo di assorbimento come unità di tempo, Le come unità di lunghezza (con , De essendo il coefficiente di diffusione all’interno dell’epitelio), si ottiene

2.2

con l’indice h o e riferito al dominio interno (foro) o esterno (epitelio). δ = Dh/De rappresenta il rapporto tra il coefficiente di diffusione nel foro Dh e il tessuto De, è maggiore di 1, e α dà la forza del flusso trasversale che mantiene il livello di morfogeno all’interno del foro. A causa della relativa lentezza della migrazione cellulare, trascuriamo la dipendenza dal tempo nell’equazione (2.2). Prendendo De/Mp come unità di pressione, la legge di Darcy si semplifica in, dove per semplicità manteniamo la stessa notazione per p e v. Dall’equazione del bilancio di massa (2.1), otteniamo la seguente equazione di Laplace che accoppia la pressione sconosciuta p alla concentrazione del chemioattrattore c:

2.3

Così, otteniamo, dove ϕ è una funzione olomorfa che soddisfa Δϕ = 0. Infine, dobbiamo prestare particolare attenzione alle condizioni limite di interfaccia. Per l’equazione (2.2), esse riguardano la continuità della concentrazione e la discontinuità del flusso dovuta al consumo di morfogeno da parte della mitosi al confine(per la dimostrazione, vedi ):

2.4

dove N è la normale esterna. Γ2 è il tasso di assorbimento vincolato al confine discusso sotto insieme ai tassi di mitosi Γ1 eal confine. La capillarità fissa il salto di pressione all’interfaccia

2.5

che dà la condizione di libero confine considerando l’effetto geometrico doveè il raggio di curvatura locale.è uguale al raggio se la geometria è un cerchio. Tuttavia, considera l’effetto locale su piccola scala di lunghezza quando il confine è perturbato. Allo stesso tempo, la velocitàdell’interfaccia differisce da quella dell’epitelio v per la proliferazione cellulare al confine e si ottiene

2.6

dove Γ1 è il tasso di mitosi e σ il numero di capillari legato alla tensione T all’interfaccia cosìLa guarigione della ferita in vivo è dominata dalla migrazione bidimensionale e i morfogeni non sono probabilmente i nutrienti, quindi Γ2 svanisce e Γ1c deve essere sostituito dase consideriamo anche la mitosi senza l’effetto quantitativo delle concentrazioni dei nutrienti. Il numero di capillari σ può coinvolgere le attività del cavo di actina (microfilamenti in fascio) nelle cellule. Durante la guarigione delle ferite embrionali, le cellule del bordo anteriore possono coordinare globalmente i loro cavi di actina che generano un effetto a livello macroscopico. Tuttavia, questo comportamento coordinato è perso negli adulti, quindi l’effetto dei cavi di actina può agire solo localmente. Questo assomiglia a σ nel nostro modello che non è efficace per grandi ferite. Considerando l’insieme delle equazioni (2.2) e (2.3) insieme all’insieme delle condizioni al contorno (2.4), (2.5) e (2.6) mostra che la migrazione guidata dalla chemiotassi è in effetti un problema a vincolo libero che coinvolge diversi parametri per rappresentare la complessità biologica e lo studio di casi semplici, per esempio la chiusura circolare, può aiutare a capire i ruoli corrispondenti. Così, presentiamo prima i risultati analitici per un foro che rimane circolare in ogni momento, poi la sua stabilità.

I risultati

3.1. Chiusura circolare regolare

Nell’approssimazione quasi statica, l’equazione (2.2) può essere risolta analiticamente e dà

3.1

I0 (risp. K0) è la funzione di Bessel modificata di ordine zero, regolare a r = 0 (risp. r → ∞). L’equazione (3.1) tiene conto della continuità all’interfaccia, essendo A data dalla continuità del flusso e si legge

3.2

con la seguente definizione per(rapporto di due funzioni Bessel successive) e l’equivalente perLa pressione P0 all’interno dell’epitelio diventa

3.3

Utilizziamo la legge di Laplace per fissare il grado di libertà sconosciuto. La funzione olomorfa ϕ, proporzionale a log(r), rappresenta una possibile forza motrice che appare all’interfaccia (cioè la cosiddetta kenotassi definita in ). Infatti, anche in assenza di morfogeni, si osserva in vitro la migrazione dell’epitelio su substrato solido, forse a causa della riorganizzazione del citoscheletro cellulare al margine della ferita. Si noti che il modello rimane valido se si scarta la chemiotassi, purché si modifichi la definizione delle unità di lunghezza e di tempo. Inoltre, C0 e P0 dipendono dal tempo attraverso R(t). Per semplicità, lasciamo cadere la dipendenza dal tempo diLa velocitàdella chiusura dedotta dall’equazione (3.5) è quindi

3.4

La velocità di chiusura è costante per i fori grandi ed è esponenzialmente piccola quando il raggio R diventa piccolo, se si limita la migrazione e la proliferazione chemotatica. Così il raggio di un grande foro inizia con una diminuzione lineare nel tempo, ma la chiusura totale richiederà un tempo infinito per un raggiungimento completo. Per i fori piccoli, la chemiotassi diventa subdominante rispetto alla kenotassi Ain all’interfaccia che controlla la dinamica di chiusura e il raggio soddisfa una legge diffusiva in t1/2 . La figura 3 mostra in funzione di R per diversi valori di α, δ e Ain/Λ e il §4 contiene una discussione dei parametri.

3.2. Perdita di circolarità

Tuttavia, l’equazione (3.4) è valida solo se si mantiene il contorno circolare. È per questo che eseguiamo un’analisi di stabilità lineare per ferite grandi (Ain ∼ 0) assumendo una piccola perturbazione armonica per il raggio come che induce variazioni sulla pressione P e sul campo di concentrazione C dello stesso ordine ε come segue:

3.5

dove il pedice i indica una quantità relativa al foro (h, 0 < r < R) o all’epidermide (e, R < r < ∞). Anche se tutte le quantità perturbative dipendono dal modo n selezionato, l’analisi lineare delle perturbazioni tratta questi modi in modo indipendente. Quindi lasciamo perdere l’indice n e calcoliamo i campi di concentrazione perturbativi ci(r) dall’equazione (2.3)

3.6

mentre il campo di pressione perturbato è dato dadove teniamo conto dei modi armonici della funzione olomorfa ϕ con B fissato dalla legge di LaplaceA causa della debolezza di ε, il nostro sistema di equazioni, una volta linearizzato, può essere risolto analiticamente e il tasso di crescita del modo n legge

3.7

dove

L’equazione (3.7) rappresenta una relazione implicita per Ωn, risolta con tecniche iterative e i valori positivi indicano i modi responsabili della destabilizzazione del bordo circolare con il procedere della migrazione. I risultati sono presentati per diversi valori di Λ, α e δ, dove Ωn è visualizzato nella figura 4. Vedi §4 per la discussione dei parametri. I risultati indicano un’instabilità che porta ad una deviazione da un cerchio in breve tempo, per n fino ad un modo critico nc (fissato dalla capillarità). È per questo che le simulazioni numeriche sono necessarie per andare oltre l’analisi lineare e considerare pienamente le non linearità.

3.3. Dinamica completa e metodi numerici

Discretizziamo c nell’equazione (2.2) e la pressione p nell’equazione (2.3) su una mesh cartesiana nello spazio e implicitamente nel tempo, usando un metodo iterativo Gauss-Seidel adattivo non lineare. Al confine del dominio, imponiamo entrambi i valori di vanità di c e il gradiente normale di p. Poi il rumore viene aggiunto su C = c + χ con Iniziando con un cerchio perfetto con R = 90, la chiusura della ferita viene seguita dal metodo level-set sviluppato in dove una funzione scalare Φ con descrive la ferita (Φ < 0), l’epitelio (Φ > 0) e l’interfaccia (Φ = 0). La normale e la curvatura nell’equazione (2.5) sono calcolate dalla geometria differenziale standard: e Φ è aggiornato dalla relazione , dove Vext è l’estensione costante di Vint sull’interfaccia dall’equazione (2.5) seguendo il gradiente Si noti che questo metodo simula una perfetta chiusura circolare senza rumore. Secondo i nostri risultati, la ferita devia da un cerchio perfetto subito dopo la crescita come mostrato nelle figure 5 e 6 e in accordo con l’analisi di stabilità.

Discussione e conclusione

Ci sono diversi parametri indipendenti in questo modello. Possiamo fissarne alcuni con i dati sperimentali pubblicati (tabella 1). La nostra unità di velocità è compatibile con la velocità di chiusura della cornea (3 giorni per un foro di raggio di circa 3 mm) dando Λ ∼ 1 per questo esperimento secondo l’equazione (3.2). Nella figura 4, variamo i parametri α e δ, che sono più difficili da stimare, e anche Λ. A causa delle grandi dimensioni delle ferite nella pratica, l’analisi di stabilità lineare dà sempre un’instabilità e questa conclusione è robusta ai cambiamenti dei parametri. Questo risultato è confermato da simulazioni completamente non lineari sotto lo stesso intervallo di parametri (figure 5 e 6). Nelle simulazioni, un grande Λ (circa 10, tempo totale circa 60) contribuisce a una chiusura più veloce rispetto a un piccolo Λ (circa 1, tempo totale circa 600). Un esempio tipico del processo di chiusura con α = 1 e δ = 2 è mostrato nella figura 5a. L’interfaccia che avanza diventa ondulata man mano che la ferita guarisce; tuttavia, quando la ferita diventa piccola, la tensione superficiale ristabilizza la ferita ad una forma a patata coerente con l’analisi di stabilità lineare. Questa tensione superficiale può anche pizzicare le ferite in pezzi più piccoli come mostrato in figura 5b(ii), figura 6 e in . Questo evento richiede all’inizio una chiusura più irregolare (frecce rosse in figura 6), quando la concentrazione di chemioattrattore è meno omogenea dato un flusso trasversale inadeguato (α = 0,1). Il pinch-off può avvenire sia nella fase intermedia che in quella finale della chiusura (frecce gialle), coerentemente con le osservazioni nella fase finale della guarigione della ferita su un monostrato di cellule MDCK (figura 6, a destra), suggerendo lo stesso comportamento in processi più complessi di guarigione della ferita.

In questo lavoro, abbiamo dimostrato teoricamente che la riepitelizzazione della ferita dà un’instabilità del confine sotto parametri clinicamente realistici. Guidato dalla chemiotassi, il nostro modello non introduce altre attività cellulari che chiudono la ferita allo stadio finale. Tuttavia, ipotizziamo che questa instabilità chemiotattica al confine della ferita possa influenzare la qualità della riparazione finale. Durante la guarigione delle ferite embrionali, dove si osserva una ricostruzione perfetta, la ferita è chiusa da un “cordone ombelicale” che rappresenta un coordinamento delle cellule del bordo anteriore facilitato dal cavo di actina. Questo meccanismo è perso nella pelle adulta, dove la ferita è chiusa dallo strisciamento delle cellule (diversi strati) sul tessuto di granulazione. Rispetto a un substrato statico in vitro, il tessuto di granulazione subisce una contrazione alla fine della riepitelizzazione da parte dei miofibroblasti. In effetti, questo scopo è quello di riunire il bordo che assomiglia al ‘cordone ombelicale’, ma la contrazione da parte di queste cellule deve essere compatibile con la costituzione sincrona del materiale, che è meccanicamente e sistematicamente una sfida

Alla fine, discutiamo il nostro modello nel contesto della guarigione della ferita cutanea in vivo. Quando la ferita va in profondità nel derma, che è il caso della maggior parte delle ferite, i due strati si comportano diversamente durante la riepitelizzazione. La profondità di una ferita contribuisce allo spessore nello strato inferiore dove viene rilasciato il chemioattrattore. Considerando la riepitelizzazione in cui solo diversi strati di cellule diventano mobili al di sopra delle pile inferiori dove viene rilasciato il chemioattrattore, la profondità della ferita contribuisce matematicamente alla forza di flusso trasversale del chemioattrattore α. Oltre ad α, che può coinvolgere la profondità della ferita, vengono considerati la geometria, la dimensione della ferita così come il rapporto del coefficiente di diffusione δ. Rispetto agli esperimenti in vivo, il processo di guarigione delle ferite umane può essere diverso da quello dei topi da esperimento a causa delle diverse proprietà biomeccaniche della pelle. Tuttavia, se si intende considerare il problema in vivo tenendo conto della bioelasticità, la sfida non deriva solo dai diversi componenti dei due strati, ma anche dal fatto che la giunzione tra lo strato dermico e quello epidermico è altamente disordinata anche per la pelle intatta, come mostrato nel nostro lavoro precedente. Un modello regolare dovrebbe essere definito nella terza dimensione che consideriamo “normale”. Inoltre, poiché il tessuto della ferita subisce un rimodellamento durante la guarigione, i parametri meccanici non possono essere considerati come costanti e il rilassamento del tessuto probabilmente evolve su una scala temporale più grande della riepitelizzazione. Infatti, questi processi di rilassamento dovrebbero essere considerati anche nel predire la qualità della riparazione finale. Prima di questo, l’irregolarità del bordo della ferita guidata dalla chemiotassi dovrebbe essere considerata come un ingrediente.

Dichiarazione di finanziamento

Questo lavoro è stato sostenuto in parte da AAP Physique Cancer 2012.

Punti di riferimento