Re-epitelizáció: a hám határának előretörése a sebgyógyulás során

Bevezetés

A felnőtt bőr három rétegből áll: a felhámból és a bőrből, amelyeket az alapmembrán választ el. Ha olyan mély sérülés történik, amely elpusztítja a dermisz egy részét, azt gyorsan helyre kell foltozni a védőgát helyreállítása érdekében . Az in vivo sebgyógyulás egy összetett javító folyamat, amelyet intra- és intercelluláris útvonalak irányítanak. A bőr integritásának helyreállítása érdekében ez a folyamat négy egymást követő, de egymást átfedő szakaszon keresztül valósul meg: alvadás, gyulladás, újraepitelizáció és remodelling. Közvetlenül a sérülést követően főként fibrinrostokból és vérlemezkékből álló vérrög képződik, amely elzárja a sebet (1. szakasz). Ezt követően a következő 2-10 napban (2. szakasz) a rögöt folyamatosan gyulladásos sejtek infiltrálják, amelyek eltakarítják a törmeléket, és kémiai faktorokat, például vaszkuláris endoteliális növekedési faktort és transzformáló növekedési faktor-bétát bocsátanak ki. Amint a kémiai gradiens kialakul, különböző sejtek toborzódnak az új szövet felépítéséhez (3. szakasz). Egyrészt a dermiszben neo-vaszkulatura és fibroblasztok (kollagént lerakó) toborzódnak, a rögöt granulációs szövetté alakítják át, amelyek táplálkozásilag és fizikailag támogatják a felső rétegek helyreállítását. Másrészt a keratinociták vándorolnak és proliferálnak a seb szélén, hogy kiterjesszék a több sejtrétegből álló, újonnan kialakult hámszőnyeget az epidermiszben. Ezt a folyamatot nevezzük újraepitelizációnak, és két-három hétig tart. A 3. szakasz végén a fibroblasztokból átalakult myofibroblasztok összehúzódnak, és megpróbálják összehúzni a sebszélt. Apoptózis révén eltűnnek a dermiszben. Az átalakulás (4. szakasz) hónapokig vagy akár évekig is folytatódik a normális bőr homoosztázisának helyreállítása érdekében. A normális anatómiai struktúra azonban nem áll helyre igazán, és a granulációs szövetből heg alakul ki. Míg ez a felnőtt emberek nagy sebeire igaz, addig az emberi embriókban lévő sebek tökéletesen záródhatnak, aminek okai nem teljesen tisztázottak. Érdekes módon a hegképződés feltehetően evolúciós áldozat a gyors sebzáródás érdekében, és ezt jelzi az intenzív és redundáns gyulladásos válasz, amely kémiai jelek felszabadításával közvetíti a sejtek szisztematikus viselkedését az újraepitelizáció során. A végső heg minden esetben a sejtek és a mikrokörnyezet közötti kölcsönhatás eredménye a négy szakasz során fizikai és kémiai tényezőkön keresztül.

Itt a re-epithelizációra összpontosítunk, amikor a keratinociták, az epidermális domináns sejtek, leválnak a bazális membránról, a sebszegély felé vándorolnak és a granulációs szövetben lévő morfogének által vezérelve proliferálnak . A közelmúltban több csoport is nagyon gondos in vitro epitélvándorlási kísérleteket végzett . A szilárd szubsztrátumon megvalósított kísérletek egy előrehaladó monoréteget foglalnak magukban, amelyet a sejtek kollektív viselkedése motivál a migráción, az erők létrehozásán és a sejtek citoszkeletonjának újrarendeződésén keresztül a peremnél. Az eredmények azt mutatják, hogy a sejtek nem intuitív módon érik el a robusztusságot a javítás során, ahol a kemotaxis nem tűnik döntőnek a globális sejtvándorlás szempontjából in vitro. Mindazonáltal az in vitro kísérletekhez képest in vivo a sebben felszabaduló bőséges morfogenetikai jelek miatt a kemotaxis dominál a sejtek kollektív viselkedésében a sebgyógyulási folyamat során. Az in vivo sebgyógyuláshoz (1a. ábra (i) (ii)) közelebb állva, mesterséges szaruhártyát állítottunk elő (1b. ábra (i) (ii)) epitélsejtek, fibroblasztok és növekedési faktorok háromdimenziós Petri-csészében történő bevezetésével. Érdekes módon mindezek a munkák a körkörös geometriára vonatkoznak, nem pedig a korábbi kísérletekben végzett lineáris vágásra . Bár jól kontrolláltak, nem világos, hogy ezek a rendszerek bemutatják-e az in vivo sebgyógyulás teljes komplexitását . Mindazonáltal mind az in vivo, mind az in vitro kísérletek rendezetlen határfejlődést mutatnak, ami a kemotaxisnak köszönhető lehetséges egyetemes szabálytalanságra utal (1. ábra).

Ebben a munkában az újraepitelizációt egy szövetben lévő kör alakú lyuk figyelembevételével írjuk le, adaptálva a morfogenetikai gradiensek által vezérelt kemotaktikus migráció közelmúltbeli dinamikus modelljét. Mivel a modell folytonos, a szövetet a sejtméretnél nagyobb, de a lyuk méreténél kisebb skálán írja le. Itt nem különböztetjük meg a sejtfajokat és a kemoattraktáns kategóriákat. Ez utóbbit a hámrétegre normális harmadik dimenzióból folyamatosan beáramló és a sejtreceptorok által felvett fluxus szolgáltatja. Amint azt a , a mozgó réteg vékonysága a háromdimenziós folyamatot kétdimenziós modellé alakítja át, ahol a lokalizált vastagságváltozás a határon hozzájárul egy T feszültséghez. Ezenkívül feltételezzük, hogy a mozgó réteg és a szubsztrátum között erős viszkózus súrlódás van, ami lehetővé teszi a Darcy-törvény felírását a szöveten belüli átlagos sebességmezőre, míg a sejt-sejt kölcsönhatások és a mitózis határfelületi peremfeltételekké alakulnak át az éles határfelületi határon. Először a fizikai modellt mutatjuk be, majd az analitikus kezelést, amely explicit megoldást ad a körkörös geometriára, és tanulmányozzuk annak stabilitását. A lineáris határ esetén ugyanis kimutattuk, hogy kis sebességeknél hosszú hullámhosszú instabilitás lép fel egy Goldstone-módnak (transzlációs invariancia) köszönhetően, amelyet a felületi feszültség önmagában nem képes megakadályozni . Intuitív módon azt várhatjuk, hogy ez eltűnik kis lyukak esetén, mivel a felületi feszültség hatása hangsúlyos. Ezzel szemben, mint az in vitro kísérletek esetében, a nagyobb lyukak kontúr-instabilitást mutathatnak, ami olyan dinamikus viselkedéshez vezethet, amelyet meg akarunk jósolni. A stabilitáselemzésen túllépve az időfüggő szabad határok problémája olyan numerikus módszereket igényel, amelyek képesek megoldani az egyenleteket a fejlődő tartományokon. Úgy döntünk, hogy problémánkat szinthalmaz módszerekkel oldjuk meg, amelyeket először Osher & Sethian fejlesztett ki az 1980-as években, és amelyek képesek automatikusan követni a mozgó határfelületeket és a topológiai változásokat, és amelyeket sikeresen alkalmaztak olyan problémákra, mint a folyadék-gáz kölcsönhatások , a képfeldolgozás és a tumor növekedése. Elméleti problémánk jellegéből adódóan a daganatok növekedésére kifejlesztett módszert választjuk. A következőkben először a modellt mutatjuk be, bemutatva a legfontosabb fizikai paramétereket, majd a gyenge amplitúdójú instabilitásra vonatkozó elemzést, végül pedig a zárvány végső állapotára vonatkozó numerikus módszereket és szimulációkat.

A modell

Morfogenetikus környezetbe merülő ρ sűrűségű kétdimenziós sejtpopulációban lévő Ω kör alakú lyukat tekintünk (2. ábra). A sejtek a morfogén gradiens mentén vándorolnak felfelé, a kemotaktikus fluxus arányos a morfogének koncentrációs gradiensével , ahol Λc egy mobilitási állandó. Az Ω lyukon belüli és kívüli morfogénmegoszlást az alulról érkező források táplálják. A mitózis csak a határon történik, a záródás pedig többnyire a vándorlással valósul meg. A sejtpopuláció tömegmérlege ekkor

2,1

A szövetben a periféria kivételével a volumetrikus növekedést (γ = 0) figyelmen kívül hagyva a sejtsűrűség állandó és ρ = ρ0 . A (2.1) egyenlet egyszerűsödik és azt adja, hogy a front normálsebessége egyenesen arányos a normál koncentrációgradienssel. Rendkívül alacsony sebességeknél a sejtvándorlás kielégíti a Darcy-törvényt , ahol Mp egy porozitási együttható, amely egyenlő a hám magasságának négyzetével osztva a súrlódási együtthatóval. Amint azt a , ez a törvény a szövetekben levezethető, amikor a fázisok közötti súrlódás vagy a hordozóval való súrlódás kiegyenlíti a sejtekre ható rugalmas feszültség hidrosztatikus részét. A seb megzavarja a környezet homoeosztatikus állapotát, és a morfogének forrása megpróbálja helyreállítani az optimális egyensúlyi értéket a c0 nyílásban. Ha ezt a koncentrációt vesszük a morfogénkoncentráció egységének (ami ), τc a felvételi időt időegységnek, Le pedig hosszegységnek (ahol , De a diffúziós együttható a hámon belül), akkor

2.2

mivel a h vagy e index a belső (lyuk) vagy a külső (hám) tartományra utal. δ = Dh/De a lyuk Dh és a szövet De diffúziós együtthatójának arányát jelenti, ez nagyobb, mint 1, és α a morfogénszintet a lyukon belül fenntartó transzverzális fluxus erősségét adja meg. A sejtvándorlás relatív lassúsága miatt a (2.2) egyenletben elhanyagoljuk az időfüggést. A De/Mp nyomásegységnek tekintve a Darcy-törvényt-ra egyszerűsítjük, ahol az egyszerűség kedvéért megtartjuk a p és v jelöléseket. A (2.1) tömegegyensúlyi egyenletből a következő Laplace-egyenletet kapjuk, amely az ismeretlen p nyomást a c kemoattraktáns koncentrációval kapcsolja össze:

2.3

Így kapjuk, ahol ϕ egy holomorf függvény, amely kielégíti Δϕ = 0. Végül különös figyelmet kell fordítanunk a határfelületi peremfeltételekre. A (2.2) egyenlet esetében ezek a koncentráció folytonosságára és a határon

a mitózis általi morfogénfogyasztás miatti fluxus diszkontinuitásra vonatkoznak (szemléltetésért lásd ):

2.4

ahol N a külső normális. Γ2 az alább tárgyalt, a határon korlátozott felvételi sebesség a határon a Γ1 ésmitózissebességekkel együtt. A kapillaritás rögzíti a nyomásugrást a határfelületen

2,5

ami a geometriai hatást figyelembe véve a szabad határfeltételt adja, ahola helyi görbületi sugár.egyenlő a sugárral, ha a geometria kör. Ez azonban kis hosszskálán veszi figyelembe a helyi hatást, amikor a határt perturbálják. Ugyanakkor a határfelületsebessége a határon történő sejtburjánzás miatt eltér a hám v sebességétől, és azt kapjuk, hogy

2.6

ahol Γ1 a mitózis sebessége és σ a kapillárisok száma a határfelületen lévő T feszültséghez viszonyítva, ígyA sebgyógyulást in vivo a kétdimenziós vándorlás uralja, és a morfogének valószínűleg nem a tápanyagok, így Γ2 eltűnik és Γ1c helyébekell lépnie, ha a mitózist is a tápanyagkoncentrációk mennyiségi hatása nélkül tekintjük. A σ kapillárisszám a sejtekben lévő aktinkábel (kötegelt mikrofilamentumok) aktivitásával függhet össze. Az embrionális sebgyógyulás során a vezetőszéli sejtek globálisan képesek koordinálni aktinkábeleiket, amelyek makroszkopikus szinten is hatást generálnak. Ez a koordinált viselkedés azonban felnőtt korban elvész, így az aktinkábelek hatása csak lokálisan érvényesülhet. Ez hasonlít a σ-ra a mi modellünkben, amely nem hatékony a nagy sebek esetében. A (2.2) és (2.3) egyenlethalmaz és a (2.4), (2.5) és (2.6) peremfeltételek együttesének figyelembevétele azt mutatja, hogy a kemotikus által vezérelt vándorlás valóban egy több paramétert tartalmazó, a biológiai komplexitást reprezentáló szabad határfeladat, és az egyszerűbb esetek, például a körkörös záródás vizsgálata segíthet a megfelelő szerepük megértésében. Ezért először a mindenkor kör alakúnak maradó lyukra vonatkozó analitikus eredményeket, majd annak stabilitását mutatjuk be.

Az eredmények

3.1. Szabályos körkörös záródás

Kvázi-statikus közelítésben a (2.2) egyenlet analitikusan megoldható, és azt adja

3.1

I0 (illetve K0) a nulla rendű, r = 0 (illetve r → ∞) pontban szabályos, módosított Bessel-függvény. A (3.1) egyenlet figyelembe veszi a folytonosságot a határfelületen, A a fluxus folytonossága által adott, és így szól

3.2

az alábbi definícióval(két egymást követő Bessel-függvény hányadosa) és az ezzel egyenértékűA hám belsejében lévő P0 nyomás

3.3

A Laplace-törvényt használjuk az ismeretlen szabadságfok rögzítésére. A log(r)-rel arányos ϕ holomorf függvény egy lehetséges hajtóerőt képvisel, amely a határfelületen jelenik meg (azaz a ) által meghatározott ún. kenotaxist. Valóban, még morfogének hiányában is megfigyelhető in vitro epitélvándorlás szilárd szubsztrátumon, talán a sejtek citoszkeletonjának átrendeződésének köszönhetően a sebszegélyen. Megjegyezzük, hogy a modell akkor is érvényes marad, ha a kemotaxist elvetjük, feltéve, hogy a hossz- és időegységek definícióját módosítjuk. Továbbá a C0 és a P0 az R(t)-en keresztül függ az időtől. Az egyszerűség kedvéért elhagyjuk az

időfüggését A (3.5. egyenletből levezetett záródássebessége ekkor

3.4

A záródás sebessége nagy lyukak esetén állandó és exponenciálisan kicsi , amikor az R sugár apróvá válik, ha korlátozzuk a kemotikus vándorlást és burjánzást. Tehát egy nagy lyuk sugara lineárisan csökkenő idővel kezdődik, de a teljes záródás teljes eléréséhez végtelen időre van szükség. Kis lyukak esetén a kemotaxis alárendelődik a kenotaxis Ainhez képest a határfelületen, amely a záródási dinamikát irányítja, és a sugár t1/2-ben diffúziós törvénynek felel meg. A 3. ábra az R függvényében mutatja α, δ és Ain/Λ különböző értékeire, a 4. § pedig a paraméterek tárgyalását tartalmazza.

3.2. A sebesség 0-hoz konvergál, ha R 0-ra megy. A körkörösség elvesztése

A (3.4) egyenlet azonban csak akkor érvényes, ha a körkörös kontúr megmarad. Ezért nagy sebek (Ain ∼ 0) esetén lineáris stabilitáselemzést végzünk, feltételezve egy kis harmonikus perturbációt a sugárra, mint ami a P nyomás és a C koncentrációs mező ε nagyságrendű változásait idézi elő az alábbiak szerint:

3.5

ahol az i index vagy a lyukhoz (h, 0 < r < R) vagy az epidermiszhez (e, R < r < ∞) viszonyított mennyiséget jelöl. Bár minden perturbatív mennyiség függ a kiválasztott n módustól, a lineáris perturbációs elemzés ezeket a módusokat egymástól függetlenül kezeli. Ezért elhagyjuk az n indexet, és a (2.3)

3 egyenletből kiszámítjuk a perturbatív koncentrációs mezőket ci(r).6

míg a perturbált nyomásmezőtadja meg, ahol figyelembe vesszük a ϕ holomorf függvény harmonikus módusait, B-vel a Laplace-törvény által rögzítettA ε gyengeségének köszönhetően egyenletrendszerünk, miután linearizáltuk, analitikusan megoldható, és az n módus növekedési rátája

3.7

ahol

A (3.7) egyenlet egy implicit összefüggést jelent az Ωn-ra, amelyet iteratív technikával oldunk meg, és pozitív értékek jelzik azokat a módusokat, amelyek a migráció előrehaladtával a körkörös határ destabilizációjáért felelősek. Az eredményeket Λ, α és δ különböző értékeire mutatjuk be, ahol Ωn a 4. ábrán látható. A paraméterek tárgyalását lásd a 4. §-ban. Az eredmények instabilitást jeleznek, amely rövid időn belül a körtől való eltéréshez vezet, n esetén egy (a kapillaritás által rögzített) kritikus nc módusig. Ezért van szükség numerikus szimulációkra, hogy túllépjünk a lineáris elemzésen és teljes mértékben figyelembe vegyük a nemlinearitásokat.

3.3. Az Ωn növekedési sebesség az n hullámszám függvényében. Teljes dinamika és numerikus módszerek

A (2.2) egyenletben szereplő c-t és a (2.3) egyenletben szereplő p nyomást térben és időben implicit módon, egy nemlineáris adaptív Gauss-Seidel iteratív módszerrel diszkretizáljuk egy kartészi hálóra . A tartomány határán a c értékek eltűnését és a p normális gradiensét is feltételezzük. Ezután a zajt hozzáadjuk a C = c + χ értékkel kezdődően egy R = 90 értékű tökéletes körből kiindulva a seb záródását az alábbiakban kifejlesztett szinthalmaz módszerrel követjük, ahol egy skalárfüggvény Φ értékkel írja le a sebet (Φ < 0), a hámot (Φ > 0) és a határfelületet (Φ = 0). A (2.5) egyenletben szereplő normális és görbület a standard differenciálgeometriával számítható: és Φ a összefüggéssel frissül, ahol Vext a (2.5) egyenletből származó Vint állandó kiterjedése a határfelületen a gradienst követve Megjegyzendő, hogy ez a módszer tökéletes körkörös záródást szimulál zaj nélkül. Eredményeink szerint a seb a növekedés után hamarosan eltér a tökéletes körtől, ahogy az 5. és 6. ábrán látható, és összhangban van a stabilitáselemzéssel.

Elképzelés és következtetés

Ez a modell több független paramétert tartalmaz. Ezek közül néhányat a publikált kísérleti adatokkal rögzíthetünk (1. táblázat). A sebességegységünk kompatibilis a szaruhártya záródási sebességével (3 nap egy körülbelül 3 mm sugarú lyuk esetén ), ami a (3.2) egyenlet szerint Λ ∼ 1-t ad erre a kísérletre. A 4. ábrán a nehezebben becsülhető α és δ paramétereket, valamint Λ-t variáljuk. A gyakorlatban a sebek nagy mérete miatt a lineáris stabilitáselemzés mindig instabilitást ad, és ez a következtetés robusztus a paraméterek változtatására. Ezt a megállapítást megerősítik a teljesen nemlineáris szimulációk ugyanabban a paramétertartományban (5. és 6. ábra). A szimulációkban a nagy Λ (kb. 10, teljes idő kb. 60) hozzájárul a gyorsabb záráshoz a kis Λ-hez (kb. 1, teljes idő kb. 600) képest. Az 5a. ábrán egy tipikus példa látható a zárási folyamatra α = 1 és δ = 2 esetén. A seb gyógyulásával az előrehaladó felület hullámossá válik; amikor azonban a seb kicsi lesz, a felületi feszültség a lineáris stabilitási elemzésnek megfelelő burgonya alakúra stabilizálja vissza a sebet. Ez a felületi feszültség a sebeket kisebb darabokra is lecsípheti, amint azt az 5b(ii) ábra, a 6. ábra és a . Ez az esemény először szabálytalanabb záródást igényel (piros nyilak a 6. ábrán), amikor a kemoattraktáns koncentrációja kevésbé homogén, mivel a keresztirányú áramlás nem megfelelő (α = 0,1). A becsípődés a záródás köztes vagy végső szakaszában is bekövetkezhet (sárga nyilak), ami összhangban van a sebgyógyulás késői szakaszában MDCK-sejtek monorétegén végzett megfigyelésekkel (6. ábra, jobbra), ami ugyanerre a viselkedésre utal a bonyolultabb sebgyógyulási folyamatokban.

Ebben a munkában elméletileg kimutattuk, hogy a seb újraepitelizációja klinikailag reális paraméterek mellett határinstabilitást ad. A kemotaxis által vezérelt modellünk nem vezet be egyéb sejtaktivitásokat, amelyek a végső stádiumban lezárják a sebet. Feltételezzük azonban, hogy ez a kemotaktikus instabilitás a seb határán befolyásolhatja a végső javítás minőségét. Az embrionális sebgyógyulás során, ahol tökéletes rekonstrukció figyelhető meg, a sebet egy “erszényes zsinór” zárja le, amely az aktinkábel által elősegített vezető szélű sejtek koordinációját jelenti. Ez a mechanizmus elveszik a felnőtt bőrben, ahol a sebet a sejtek (több rétegben) a granulációs szöveten való kúszása zárja be. Az in vitro statikus szubsztráthoz képest a granulációs szövet az újraepitelizáció végén a myofibroblasztok révén összehúzódáson megy keresztül . Valójában ez a cél a perem összefogása, ami hasonlít az “erszényzsinórhoz”, de e sejtek összehúzódásának összeegyeztethetőnek kell lennie a szinkron anyagkonstitúcióval, ami mechanikusan és szisztematikusan kihívást jelent .

A végén a modellünket a bőr sebgyógyulásának in vivo kontextusában tárgyaljuk. Mivel a seb mélyen a dermiszbe hatol, ami a legtöbb seb esetében így van, a két réteg eltérően viselkedik a reepithelizáció során. A seb mélysége hozzájárul az alsó réteg vastagságához, ahol a kemoattraktáns felszabadul. Figyelembe véve az újraepitelizációt, ahol csak néhány sejtréteg válik mozgóvá az alsó halmazok felett, ahol a kemoattraktáns felszabadul, a seb mélysége matematikailag hozzájárul a keresztirányú kemoattraktáns-áramlási erősséghez α. Az α mellett, amely magában foglalhatja a seb mélységét, a seb geometriáját, a seb méretét, valamint a δ diffúziós együttható arányát is figyelembe vesszük. Az in vivo kísérletekkel összehasonlítva az emberi sebgyógyulási folyamat a bőr eltérő biomechanikai tulajdonságai miatt eltérhet a kísérleti egerekétől. Ha azonban a bioelaszticitást figyelembe véve in vivo kívánjuk vizsgálni a problémát, a kihívást nem csak a két réteg eltérő összetevői jelentik, hanem az a tény is, hogy a dermális és epidermális réteg közötti átmenet még az ép bőr esetében is erősen rendezetlen, amint azt korábbi munkánkban kimutattuk. Egy szabályos mintázatot kell meghatározni a harmadik dimenzióban, amelyet “normálisnak” tekintünk. Továbbá, mivel a sebszövet a gyógyulás során átalakul, a mechanikai paraméterek nem tekinthetők konstansnak, és a szövet relaxációja valószínűleg nagyobb időskálán fejlődik, mint a reepithelizáció. Valójában ezeket a relaxációs folyamatokat is figyelembe kell venni a végső javítás minőségének előrejelzésében. Ezt megelőzően a sebhatár kemotaxis által vezérelt szabálytalanságát is figyelembe kell venni, mint hozzávalót.

Finanszírozási nyilatkozat

Ezt a munkát részben az AAP Physique Cancer 2012 támogatta.

Lábjegyzetek