Re-epithelialization: advancing epithelium frontier during wound healing

Introduktion

Voksen hud består af tre lag: epidermis og dermis, der er adskilt af basalmembranen. Når der opstår en dyb skade, som ødelægger en del af dermis, skal den repareres hurtigt for at genoprette den beskyttende barriere . Sårheling in vivo er en kompleks reparationsproces, der styres af intra- og intercellulære veje. For at genoprette hudens integritet gennemføres denne proces i fire på hinanden følgende, men overlappende faser: koagulering, inflammation, reepithelisering og remodellering. Umiddelbart efter en skade dannes der en blodprop, der hovedsagelig består af fibrinfibre og blodplader, som lukker såret (fase 1). I de følgende 2-10 dage (fase 2) infiltreres blodproppen løbende af inflammatoriske celler, som rydder op og frigiver kemiske faktorer som f.eks. vaskulær endotelial vækstfaktor og transformerende vækstfaktor-beta. Når den kemiske gradient er etableret, rekrutteres forskellige celler til at opbygge det nye væv (fase 3). På den ene side rekrutteres nyvaskulatur og fibroblaster (som afsætter kollagen) i dermis, hvorved blodproppen omdannes til et granulationsvæv, som ernæringsmæssigt og fysisk støtter reparationen af de øverste lag. På den anden side migrerer og prolifererer keratinocytter i kanten af såret for at udvide det nyligt dannede epitheltæppe, der består af flere cellelag i epidermis. Denne proces kaldes re-epithelialisering og varer i to til tre uger. I slutningen af fase 3 trækker myofibroblaster, der er omdannet fra fibroblaster, sig sammen og forsøger at bringe sårkanten sammen. De forsvinder ved apoptose i dermis. Omdannelsen (fase 4) fortsætter i flere måneder eller endog i årevis for at genoprette den normale homoeostase i huden. Den normale anatomiske struktur genoprettes dog ikke helt, og der dannes et ar af granulationsvævet. Mens dette gælder for store sår hos voksne mennesker, kan sår hos menneskelige embryoner være fuldstændig lukkede, uden at man helt forstår årsagerne hertil. Interessant nok menes ar-dannelsen at være et evolutionært offer for at opnå hurtig sårlukning, og dette indikeres af det intense og redundante inflammatoriske respons, som formidler den systematiske celleadfærd under reepithelisering ved at frigive kemiske signaler. I alle tilfælde er det endelige ar et resultat af samspillet mellem celler og mikromiljøet gennem fysiske og kemiske faktorer i løbet af de fire faser.

Her fokuserer vi på reepithelialisering, når keratinocytter, de epidermale dominerende celler, løsner sig fra basalmembranen, migrerer mod sårkanten og prolifererer, drevet af morfogener i granulationsvævet . Der er for nylig blevet udført meget omhyggelige in vitro-epitelmigrationsforsøg af flere grupper . De er udført på et fast substrat og omfatter et fremadskridende monolag, der er motiveret af cellernes kollektive adfærd gennem migration, generering af kræfter og reorganisering af cellecytoskelettet ved kanten. Resultaterne viser en ikke-intuitiv måde, hvorpå cellerne opnår robusthed under reparationen, hvor kemotaxis ikke synes at være afgørende for den globale cellevandring in vitro. Ikke desto mindre dominerer kemotaxis på grund af de rigelige morfogene signaler, der frigives i såret in vivo sammenlignet med in vitro-eksperimenter, cellernes kollektive adfærd under sårhelingsprocessen. Tættere på sårheling in vivo (figur 1a(i)(ii)) er en kunstig hornhinde blevet rekonstrueret (figur 1b(i)(ii)) ved at indføre epitelceller, fibroblaster og vækstfaktorer i en tredimensionel Petriskål. Det er interessant, at alle disse arbejder vedrører den cirkulære geometri snarere end det lineære snit, der er udført i tidligere eksperimenter . Selv om disse systemer er velkontrollerede, er det uklart, om de repræsenterer hele kompleksiteten af in vivo-sårheling . Ikke desto mindre viser både in vivo og in vitro-eksperimenterne en uordnet udvikling af grænserne, hvilket tyder på en mulig universel uregelmæssighed som følge af kemotaxi (figur 1).

I dette arbejde beskriver vi re-epitheliseringen ved at betragte et cirkulært hul i et væv, idet vi tilpasser en nyere dynamisk model af kemotaktisk migration drevet af morfogenetiske gradienter. Da modellen er kontinuerlig, beskriver den vævet på en skala, der er større end cellestørrelsen, men mindre end størrelsen af hullet. Her skelner vi ikke mellem cellearter eller kategorier af kemotiltrækkende stoffer. Sidstnævnte tilføres kontinuerligt af en indgående strøm fra den tredje dimension, der er normal for epithellaget, og optages af cellereceptorer. Som vist i , omdanner det bevægelige lags tyndhed den tredimensionelle proces til en todimensionel model, hvor den lokaliserede tykkelsesvariation ved grænsen bidrager til en spænding T. Desuden antager vi, at der eksisterer en stærk viskøs friktion mellem det bevægelige lag og substratet , hvilket gør det muligt at skrive en Darcy’s lov for det gennemsnitlige hastighedsfelt inde i vævet, mens celle-celle-interaktioner og mitose omdannes til grænsefladegrænsebetingelser i grænsen for skarpe grænseflader. Vi præsenterer først den fysiske model og derefter den analytiske behandling, der giver en eksplicit løsning for den cirkulære geometri og en undersøgelse af dens stabilitet. I tilfælde af en lineær grænse er det faktisk blevet vist, at der opstår en ustabilitet med lang bølgelængde ved lave hastigheder på grund af en Goldstone-mode (translationel invarians), som overfladespænding alene ikke kan forhindre . Intuitivt kan man forvente, at den forsvinder for små huller, efterhånden som overfladespændingseffekten forstærkes. Tværtimod kan større huller, som i eksperimenter in vitro, udvise ustabilitet i konturen, hvilket fører til dynamisk adfærd, som vi søger at forudsige. For at gå videre end stabilitetsanalysen kræver det tidsafhængige problem med frie grænser numeriske metoder, som kan løse ligninger på områder, der udvikler sig. Vi vælger at løse vores problem ved hjælp af level-set-metoder, der først blev udviklet i 1980’erne af Osher & Sethian , som er i stand til automatisk at spore bevægelige grænseflader og topologiske ændringer, og som med succes er blevet anvendt til problemer som f.eks. væske-gas-interaktioner , billedbehandling og tumorvækst . På grund af arten af vores teoretiske problem vælger vi den metode, der er udviklet til tumorvækst . I det følgende præsenterer vi først modellen og introducerer de mest relevante fysiske parametre, derefter analysen for svag amplitudeinstabilitet og endelig numeriske metoder og simuleringer for lukningens endelige tilstand.

Modellen

Vi betragter et cirkulært hul Ω i en todimensionel cellepopulation med en tæthed ρ nedsænket i et morfogenetisk miljø (figur 2). Cellerne migrerer op ad morfogengradienten, idet den kemotaktiske flux er proportional med koncentrationsgradienten af morfogener , idet Λc er en mobilitetskonstant. Morfogenfordelingen inden for og uden for hullet Ω får næring fra kilder, der kommer nedefra. Mitose sker kun ved grænsen, og lukningen opnås for det meste ved migration. Massebalancen for cellepopulationen er da

2,1

Nægtes volumetrisk vækst (γ = 0) i vævet undtagen i periferien, er celletætheden konstant, og ρ = ρ0. Ligning (2.1) forenkles til og giver, at frontens normalhastighed er direkte proportional med den normale koncentrationsgradient. Ved ekstremt lave hastigheder opfylder cellevandringen en Darcy-lov , idet Mp er en porøsitetskoefficient lig med kvadratet på epithelhøjden divideret med en friktionskoefficient. Som vist i , udledes denne lov i væv, når friktion mellem faser eller friktion med et substrat opvejer den hydrostatiske del af den elastiske spænding, der virker på cellerne . Såret forstyrrer den homøostatiske tilstand i omgivelserne, og en kilde af morfogener vil forsøge at genoprette en optimal ligevægtsværdi i åbningen c0. Hvis man tager denne koncentration som enhed for morfogenkoncentrationen (hvilket giver ), τc optagelsestiden som tidsenhed, Le som længdeenhed (med , De er diffusionskoefficienten inde i epitelet), får vi

2,2

med indekset h eller e, der henviser til det indre (hul) eller ydre (epitelet) domæne. δ = Dh/De repræsenterer forholdet mellem diffusionskoefficienten i hullet Dh og vævet De, det er større end 1, og α angiver styrken af den tværgående flux, som opretholder morfogenniveauet inde i hullet. På grund af den relative langsommelighed af cellemigrationen negligerer vi tidsafhængigheden i ligning (2.2). Ved at tage De/Mp som trykenhed forenkles Darcys lov til, hvor vi for enkelhedens skyld beholder den samme notation for p og v. Ud fra massebalancens ligning (2.1) får vi følgende Laplace-ligning, der kobler det ukendte tryk p til den kemotiltrækkende koncentration c:

2.3

Så får vi, hvor ϕ er en holomorf funktion, der opfylder Δϕ = 0. Endelig skal vi være særligt opmærksomme på grænsefladens randbetingelser. For ligning (2.2) drejer de sig om koncentrationskontinuiteten og fluxdiskontinuiteten på grund af morfogenforbruget ved mitose ved grænsen

(for demonstration, se ):

2.4

hvor N er den ydre normal. Γ2 er den optagelseshastighed, der er begrænset ved grænsen, som diskuteres nedenfor sammen med mitosehastighederne Γ1 ogved grænsen. Kapillaritet fastlægger trykspringet ved grænsefladen

2,5

som giver den frie grænsebetingelse under hensyntagen til den geometriske effekt, hvorer den lokale krumningsradius.er lig med radius, hvis geometrien er en cirkel. Den tager imidlertid hensyn til den lokale effekt på en lille længde skala, når grænsen forstyrres. Samtidig adskiller grænsefladens hastighedsig fra epitelets hastighed v på grund af celleproliferationen ved grænsen, og vi får

2.6

hvor Γ1 er mitosehastigheden og σ kapillartallet relateret til spændingen T ved grænsefladen, såSårheling in vivo domineres af todimensionel migration, og morfogenerne er sandsynligvis ikke næringsstofferne, så Γ2 forsvinder, og Γ1c må erstattes af, hvis vi også betragter mitose uden den kvantitative effekt af næringsstofkoncentrationerne. Kapillartallet σ kan involvere aktiviteterne i aktinkablet (bundtede mikrofilamenter) i cellerne. Under embryonal sårheling kan de ledende kantceller koordinere deres aktinkabler globalt, hvilket genererer en effekt på makroskopisk niveau. Denne koordinerede adfærd er imidlertid gået tabt hos voksne, så virkningen af aktinkabler kan kun virke lokalt. Dette ligner σ i vores model, som ikke er effektiv for store sår. Hvis man betragter sætningen af ligninger (2.2) og (2.3) sammen med sætningen af randbetingelser (2.4), (2.5) og (2.6), viser det, at kemotatisk drevet migration faktisk er et problem med frie grænser, der involverer flere parametre for at repræsentere den biologiske kompleksitet, og undersøgelsen af simple tilfælde, f.eks. den cirkulære lukning, kan hjælpe til at forstå deres tilsvarende roller. Vi præsenterer således først de analytiske resultater for et hul, der forbliver cirkulært til enhver tid, og derefter dets stabilitet.

Resultaterne

3.1. Regelmæssig cirkulær lukning

I den kvasistatiske tilnærmelse kan ligning (2.2) løses analytisk og giver

3.1

I0 (hhv. K0), der er den modificerede Bessel-funktion af orden nul, regelmæssig ved r = 0 (hhv. r → ∞). Ligning (3.1) tager hensyn til kontinuiteten ved grænsefladen, idet A er givet ved fluxkontinuiteten, og lyder

3.2

med følgende definition for(forholdet mellem to på hinanden følgende Bessel-funktioner) og den tilsvarende forTrykket P0 inde i epitelet bliver

3,3

Vi bruger Laplace-loven til at fastsætte den ukendte frihedsgrad. Den holomorfe funktion ϕ, der er proportional med log(r), repræsenterer en mulig drivkraft, der optræder ved grænsefladen (dvs. den såkaldte kenotaxis, der er defineret i ). Selv i fravær af morfogener observeres der faktisk in vitro epithelmigration på fast substrat, måske på grund af reorganiseringen af det cellulære cytoskelet ved sårkanten. Bemærk, at modellen fortsat er gyldig, hvis vi ser bort fra kemotaksen, forudsat at definitionen af længde- og tidsenheder ændres. Desuden er C0 og P0 afhængige af tiden via R(t). For enkelhedens skyld dropper vi tidsafhængigheden af

Lukningshastigheden, der udledes af ligning (3.5), er da

3.4

Slutningshastigheden er konstant for store huller og er eksponentielt lille , når radius R bliver lille, hvis man begrænser sig på kemotatisk migration og proliferation. Så radius af et stort hul begynder med et lineært fald i tid, men den samlede lukning vil tage uendelig lang tid for en fuldstændig opnåelse. For små huller bliver kemotaxis subdominant i forhold til kenotaxis Ain ved grænsefladen, som styrer lukningsdynamikken, og radius opfylder en diffusionslov i t1/2 . Figur 3 viser som en funktion af R for forskellige værdier af α, δ og Ain/Λ, og §4 indeholder en diskussion af parametre.

3.2. Tab af cirkularitet

Ligning (3.4) er dog kun gyldig, hvis den cirkulære kontur bevares. Derfor foretager vi en lineær stabilitetsanalyse for store sår (Ain ∼ 0), idet vi antager en lille harmonisk forstyrrelse af radius , der forårsager variationer i trykket P og koncentrationsfeltet C af samme orden ε som følger:

3.5

hvor subscript i angiver enten en størrelse i forhold til hullet (h, 0 < r < R) eller i forhold til epidermis (e, R < r < ∞). Selv om alle perturbative størrelser afhænger af den valgte tilstand n, behandler den lineære perturbationsanalyse disse tilstande uafhængigt af hinanden. Så vi dropper n-indekset og beregner de perturbative koncentrationsfelter ci(r) ud fra ligning (2.3)

3.6

, mens det forstyrrede trykfelt er givet ved, hvor vi tager hensyn til de harmoniske modus af den holomorfe funktion ϕ med B fastsat ved Laplace-lovenPå grund af ε’s svaghed kan vores ligningssystem, når det er lineariseret, løses analytisk, og vækstraten for modus n lyder

3.7

hvor

Sammenligning (3.7) repræsenterer et implicit forhold for Ωn, der løses ved iterative teknikker, og positive værdier angiver de modus, der er ansvarlige for destabiliseringen af den cirkulære grænse, efterhånden som migrationen skrider frem. Resultaterne er præsenteret for forskellige værdier af Λ, α og δ, hvor Ωn er vist i figur 4. Se § 4 for en diskussion af parametrene. Resultaterne viser en ustabilitet, der fører til en afvigelse fra en cirkel i løbet af kort tid for n op til en kritisk tilstand nc (fastsat af kapillariteten). Det er grunden til, at numeriske simuleringer er nødvendige for at gå ud over den lineære analyse og fuldt ud tage hensyn til de ikke-lineære egenskaber.

3.3. Fuld dynamik og numeriske metoder

Vi diskretiserer c i ligning (2.2) og trykket p i ligning (2.3) på et kartesisk net i rummet og implicit i tiden ved hjælp af en ikke-lineær adaptiv Gauss-Seidel iterativ metode . Ved domænegrænsen pålægger vi både forsvindende værdier for c og normal gradient for p. Derefter tilføjes støjen på C = c + χ med Med udgangspunkt i en perfekt cirkel med R = 90 følges sårlukningen ved hjælp af den level-set-metode, der er udviklet i , hvor en skalarfunktion Φ med beskriver såret (Φ < 0), epitelet (Φ > 0) og grænsefladen (Φ = 0). Normalen og krumningen i ligning (2.5) er beregnet ved hjælp af standarddifferentialgeometri: og Φ opdateres ved relationen , hvor Vext er den konstante forlængelse af Vint på grænsefladen fra ligning (2.5), der følger gradienten Bemærk, at denne metode simulerer en perfekt cirkulær lukning uden støj. Ifølge vores resultater afviger såret fra en perfekt cirkel kort efter væksten, som vist i figur 5 og 6 og i overensstemmelse med stabilitetsanalysen.

Diskussion og konklusion

Der er flere uafhængige parametre i denne model. Vi kan fastsætte nogle af dem med de offentliggjorte eksperimentelle data (tabel 1). Vores hastighedsenhed er forenelig med corneaens lukkehastighed (3 dage for et hul med en radius på ca. 3 mm ), hvilket giver Λ ∼ 1 for dette forsøg i henhold til ligning (3.2). I figur 4 varierer vi parametrene α og δ, som er vanskeligere at estimere, og også Λ. På grund af den store størrelse af sårene i praksis giver den lineære stabilitetsanalyse altid en ustabilitet, og denne konklusion er robust over for parameterændringer. Dette resultat bekræftes af fuldt ikke-lineære simuleringer inden for samme parameterområde (figur 5 og 6). I simuleringerne bidrager et stort Λ (ca. 10, samlet tid ca. 60) til en hurtigere lukning sammenlignet med et lille Λ (ca. 1, samlet tid ca. 600). Et typisk eksempel på lukningsprocessen med α = 1 og δ = 2 er vist i figur 5a. Den fremadgående grænseflade bliver bølget, efterhånden som såret heler; men når såret bliver lille, stabiliserer overfladespændingen såret igen til en kartoffelform, der er i overensstemmelse med den lineære stabilitetsanalyse. Denne overfladespænding kan også afklemme sårene til mindre stykker, som vist i figur 5b(ii), figur 6 og i . Denne begivenhed kræver i første omgang en mere uregelmæssig lukning (røde pile i figur 6), når koncentrationen af kemoattraktivt stof er mindre homogen på grund af utilstrækkelig tværgående flux (α = 0,1). Afklemningen kan ske både i mellem- og slutfasen af lukningen (gule pile), hvilket stemmer overens med observationer i den sene fase af sårheling på et monolag af MDCK-celler (figur 6, til højre), hvilket tyder på den samme adfærd i mere komplekse sårhelingsprocesser.

I dette arbejde har vi teoretisk vist, at sårreepithelisering giver en grænseinstabilitet under klinisk realistiske parametre. Drevet af kemotaxis introducerer vores model ikke andre celleaktiviteter, som lukker såret i den endelige fase. Vi formoder imidlertid, at denne kemotaktiske ustabilitet ved sårets grænse kan påvirke kvaliteten af den endelige reparation. Under embryonal sårheling, hvor der observeres perfekt genopbygning, lukkes såret ved hjælp af en “snor”, som repræsenterer en koordinering af cellerne i den forreste kant, der fremmes af aktinkablet . Denne mekanisme er gået tabt i den voksne hud, hvor såret lukkes ved, at cellerne (i flere lag) kravler rundt på granulationsvævet . Sammenlignet med et statisk substrat in vitro undergår granulationsvævet en sammentrækning ved slutningen af reepitheliseringen af myofibroblaster . Dette formål er faktisk at bringe kanten sammen, hvilket ligner en “pungsnor”, men disse cellers sammentrækning skal være forenelig med den synkrone materialekonstitution, hvilket mekanisk og systematisk er en udfordring .

Til sidst diskuterer vi vores model i forbindelse med hudens sårheling in vivo . Da såret går dybt ind i dermis, hvilket er tilfældet for de fleste sår, opfører de to lag sig forskelligt under re-epithelisering. Dybden af et sår bidrager til tykkelsen i det nederste lag, hvor kemoattraktanten frigives. Hvis man tager hensyn til reepitheliseringen, hvor kun flere cellelag bliver bevægelige over de nederste stakke, hvor kemoattraktanten frigives, bidrager sårets dybde matematisk til den tværgående kemoattraktantfluxstyrke α. Ud over α, som kan involvere sårets dybde, tages der hensyn til geometrien, sårets størrelse samt diffusionskoefficientforholdet δ. Sammenlignet med eksperimenter in vivo kan den menneskelige sårhelingsproces være anderledes end den i forsøgsmus på grund af forskellige biomekaniske egenskaber i huden. Men hvis man har til hensigt at overveje problemet in vivo under hensyntagen til bioelasticiteten, skyldes udfordringen ikke kun de forskellige komponenter i de to lag, men også det faktum, at overgangen mellem det dermale og det epidermale lag er meget uordnet, selv for intakt hud, som vist i vores tidligere arbejde. Der skal defineres et regelmæssigt mønster i den tredje dimension, som vi betragter som “normal”. Da sårvævet undergår en remodellering under helingen, kan de mekaniske parametre heller ikke betragtes som konstanter, og vævets afslapning udvikler sig sandsynligvis på en større tidsskala end reepitheliseringen. Disse afslapningsprocesser bør også tages i betragtning ved forudsigelse af kvaliteten af den endelige reparation. Inden da bør uregelmæssigheden af sårgrænsen drevet af kemotaxis betragtes som en ingrediens.

Fondserklæring

Dette arbejde blev delvist støttet af AAP Physique Cancer 2012.

Fodnoter