Fluoreszenz ist eines der wichtigsten und nützlichsten Werkzeuge im Werkzeugkasten eines Biologen. In der Biologie werden in fast allen Bereichen, von der Physiologie bis zur Immunologie, fluoreszierende Moleküle (auch Fluorophore genannt) verwendet, um Proteine nachzuweisen. Die spezifische Wissenschaft hinter der Funktionsweise der Fluoreszenz kann jedoch verwirrend sein oder übersehen werden.
Keine Angst! In diesem Artikel erläutern wir die wichtigsten Punkte der Fluoreszenz, damit Sie der Experte werden können, der Sie schon immer sein wollten.
Was genau ist Fluoreszenz?
Laut Definition ist Fluoreszenz eine Art von Photolumineszenz, d. h. sie tritt auf, wenn ein Molekül durch ultraviolette oder sichtbare Lichtphotonen angeregt wird. Genauer gesagt ist Fluoreszenz das Ergebnis eines Moleküls, das Licht mit einer bestimmten Wellenlänge absorbiert und Licht mit einer längeren Wellenlänge emittiert.
Details, bitte
Glücklicherweise hat Dr. Aleksander Jablonski diesem Thema sein Leben gewidmet. Er entwickelte schließlich das Jablonski-Diagramm, um die Absorption und Emission von Licht zu beschreiben. Kurz gesagt, sind die drei Schritte der Fluoreszenz die Absorption (oder Anregung), der nicht-strahlende Übergang (oder die Lebensdauer im angeregten Zustand) und die Fluoreszenzemission.1
Abbildung 1. Jablonski-Diagramm. S0 und S1 stehen für verschiedene elektronische Zustände. Die anderen Zahlen (hier 0-3) stellen Schwingungszustände dar. Mit freundlicher Genehmigung von Jacobkhed.
Schritt 1: Anregung
Rückblende zur Allgemeinen Chemie: Sichtbares Licht besteht aus Elementarteilchen, die Photonen genannt werden. Diese Teilchen sind essentielle Energiepakete, die, wenn sie absorbiert werden, das lichtabsorbierende Molekül auf ein höheres Energieniveau bringen oder „anregen“. Im Falle der Fluoreszenz absorbieren Fluorophore sichtbares Licht, das in der Regel von einer Glühlampe oder einem Laser geliefert wird, was zu einem angeregten elektronischen Singulett-Zustand (S1) des Moleküls führt.
Schritt 2: Lebensdauer des angeregten Zustands
Wie wir alle wissen, ist es das Ziel eines Atoms, sich in einem möglichst niedrigen Energiezustand zu befinden. Wenn also ein Fluorophor zu einem höheren elektronischen Zustand angeregt wird, will es sofort Energie abgeben; daher dauert dieser angeregte Zustand, der als Lebensdauer des angeregten Zustands bekannt ist, nicht sehr lange (normalerweise 1-10 Nanosekunden). Dennoch ist dieser Prozessschritt unglaublich wichtig, denn während dieser Zeit beginnt die Energie von S1 zu einem „entspannten“ angeregten Singulett-Zustand zu zerfallen, von dem die Fluoreszenzemission ausgeht.
Schritt 3: Emission
Und endlich sind wir bereit für Fluoreszenz! Ausgehend vom „entspannten“ angeregten Zustand zerfällt das energiereiche Photon schnell in den Grundzustand und gibt diese überschüssige Energie als Lichtphoton ab. Dieser Energieübergang ist uns als Fluoreszenz bekannt. Interessanterweise ist die Energie des nun fluoreszierenden Photons geringer als die Energie des Anregungsphotons, da ein Teil der Energie bereits während der Lebensdauer des angeregten Zustands freigesetzt wurde. Die bei der Fluoreszenz freigesetzte Energie hat also immer eine längere Wellenlänge als die für die Anregung benötigte.
Wie macht sich die Durchflusszytometrie fluoreszierende Moleküle zunutze?
Wir haben das Konzept und die Grundlagen der Durchflusszytometrie in früheren Artikeln und einem Webinar behandelt, also gehen Sie zurück und frischen Sie das Thema bei Bedarf auf.
Bereit? Los geht’s!
Beim Umgang mit fluoreszierenden Molekülen müssen wir besonders auf den Unterschied zwischen Anregungs- und Emissionswellenlänge oder -energie achten, der auch als Stokes-Verschiebung bezeichnet wird. Die Bedeutung der Stokes-Verschiebung liegt in ihrer Einfachheit: Sie ermöglicht es uns festzustellen, ob die Wellenlänge des emittierten Lichts und die Wellenlänge des Anregungslichts groß genug sind, um sie zuverlässig voneinander zu unterscheiden. Da die Auslesung der Durchflusszytometrie ausschließlich auf Fluoreszenz beruht, ist es unerlässlich, diesen Parameter zu kennen, da sonst die Gefahr besteht, dass unzuverlässige Poop-Emoji-Daten erzeugt werden.
Außerdem ist es äußerst wichtig, das Absorptions- und Emissionsspektrum für jedes Fluorophor im Auge zu behalten und zu wissen, wie verschiedene Laser mit dem betreffenden Fluorophor interagieren können. In einem Durchflusszytometer emittiert der Argonionenlaser beispielsweise 488 nm Licht, das das Fluorophor Fluoresceinisothiocyanat (FITC) anregt. Da die 488 nm sehr nahe am Absorptionsmaximum von FITC liegen, führt die Anregung zu einer hohen FITC-Emission. Wird FITC jedoch mit einer anderen Wellenlänge eines anderen Lasers innerhalb seines Absorptionsspektrums angeregt, emittiert es Licht im gleichen Spektrum, jedoch nicht mit der gleichen Intensität.
Und das war’s: eine kurze Einführung/Erinnerung in die Fluoreszenz und ihre Beziehung zu fluoreszierenden Molekülen, die in der Durchflusszytometrie verwendet werden. Fragen? Kommentare? Lassen Sie es uns wissen!