5.5.9 Trikarboksyylihappokierto
Pyruvaatti on oksidatiivisen glukoosiaineenvaihdunnan katabolisen sekvenssin haarautumispisteessä TCA-syklissä ja glukoneogeneettisessä polussa C3-esiasteista. Molemmissa reiteissä pyruvaatti tulee TCA-kiertoon, jossa se joko dekarboksyloituu oksidatiivisesti asetyyli-CoA:ksi pyruvaattidehydrogenaasin kautta tai karboksyloituu oksaloasetaatiksi pyruvaattikarboksylaasireaktiossa. Koska PC ja PDH kilpailevat pyruvaatista, ne ovat avainasemassa anapleroottisen (eli täydentävän) ja oksidatiivisen aineenvaihdunnan säätelyn kannalta. Cohen ja työtoverit (1979b; Cohen, 1983, 1987a,b,c) käyttivät merkityn ja merkitsemättömän alaniinin tai pyruvaatin ja etanolin yhdistelmiä tutkiakseen maksan substraattikilpailua TCA-kiertoon pääsystä perfusoidun rotan ja hiiren maksan erilaisissa hormonaalisissa ja ravitsemuksellisissa tiloissa.
Kun alaniini oli ainoa maksan substraatti, glutamaatin ja glutamiinin C2, C3 ja C4 leimattiin helposti, kuten TCA-syklin topologian perusteella odotettiin (Cohen ym, 1979b; Cohen, 1987a). Alaniini transaminoituu pyruvaatiksi, joka joko dekarboksyloituu asetyyli-CoA:ksi tai karboksyloituu oksaloasetaatiksi. Asetyyli-CoA yhdistetään sitraatiksi ja myöhemmin α-ketoglutaraatiksi, joka puolestaan voidaan transaminoida glutamaatiksi. Toisaalta oksaloasetaatti on tasapainossa malaatin ja fumaraatin kanssa (ks. kohta 5.5.8), ja leima sekoittuu oksaloasetaatin C2- ja C3-osiin. Tällaisten oksaloasetaatin isotoopomeerien kondensoituminen asetyyli-CoA:n kanssa sitraattisyntaasireaktiossa synnyttää myöhemmin – ja α-ketoglutaraattia ja siten – ja glutamaattia. PC:n ja PDH:n kautta TCA-kiertoon tulevan pyruvaatin suhteellista osuutta voidaan näin ollen arvioida glutamaatti C2:n ja C4:n suhteellisen rikastumisen perusteella. Cohen (1983, 1987c) on laskenut PC:n ja PDH:n virtaussuhteet, jotka vaihtelivat 1,2:sta 2,6:een ja 7,7:ään, kun oletuksena on ensimmäisen kertaluvun malli, jossa otetaan huomioon vain yksi TCA-syklin kierros ja merkin jatkuva kierrättäminen jätetään huomiotta (ks. kohta 5.3.7), PC:n ja PDH:n virtausnopeuden suhdeluvut olivat 1,2:sta 2,6:een ja 7,7:ään, jotka laskettiin hyvin ruokittujen, diabeettisten ja 24 tuntia paastonneiden luovuttajarottien maksoissa vastaavasti. Diabeettisessa maksassa in vitro-inkubointi insuliinin kanssa ei muuttanut kahden vaihtoehtoisen reitin kautta TCA-kiertoon kanavoituvan pyruvaatin suhteellista osuutta.
Toisin kuin kokeissa, joissa alaniini oli maksan aineenvaihdunnan ainoa substraatti, merkitsemättömän etanolin samanaikainen lisääminen johti siihen, että glutamaatti C4:ssä ja glutamiini C4:ssä esiintyi olennaisilta osin merkitsemätöntä glutamaattia (Cohen et al., 1979b). Etanoli, jonka alkoholidehydrogenaasi hapettaa helposti asetaldehydiksi ja edelleen asetaatiksi, toimii asetyyli-CoA:n lisälähteenä. Tulokset osoittivat, että etanolista peräisin oleva asetyyli-CoA kilpailee tehokkaasti PDH:n kautta TCA-kiertoon tulevan asetyyli-CoA:n kanssa. Näin ollen vaihtoehtoisen asetyyli-CoA-lähteen läsnä ollessa alaniini pääsi TCA-kiertoon lähes yksinomaan PC-reaktion kautta. Lisäksi alaniinin ja etanolin yhteistoimitus lisäsi PC-reaktion kautta tapahtuvan alaniinin kulutuksen nopeutta lähes 50 prosentilla verrattuna maksaan, jota perfusoitiin pelkällä alaniinilla. Tämä tulos ei ole odottamaton, kun otetaan huomioon PC-reaktio, jota säädellään asetyyli-CoA:n määrällä. Kohonnut asetyyli-CoA-pitoisuus, jota oli saatavilla etanolin metaboliasta, lisäsi PC:n kautta kulkevaa virtausta, jotta oksaloasetaattivarasto kasvaisi asetyyli-CoA:n nopeampaa kulutusta varten TCA-syklissä. Samanlaisia kokeita, joissa substraatteina käytettiin leimattua pyruvaattia + NH4C1:tä ja etanolia, tehtiin ja niistä saatiin vastaavat tulokset (Cohen, 1987a,b). Lisäksi Nedelec ym. (1990b) käyttivät Cohenin (1983) ehdottamaa mallia arvioidessaan viruksen aiheuttaman myeloproliferatiivisen leukemian vaikutusta maksan aineenvaihduntaan. Paastoavien luovuttajien infektoituneiden maksojen alaniinimetabolian todettiin olevan samanlainen kuin ruokittujen kontrollien. Molempien ryhmien maksoissa PC:n osuus verrattuna PDH:n osuuteen alaniinin virrasta TCA-sykliin oli pienempi verrattuna paastoaviin kontrolleihin. PC/PDH-vuon muuttunut suhde leukemiaa sairastavissa paastoiduissa maksoissa selittyi triglyseridien ja siten asetyyli-CoA:n saatavuuden jyrkällä vähenemisellä näissä elimissä.
13C MRS tarjoaa ainutlaatuisen mahdollisuuden seurata etanolin ja alaniinin metaboliaa samanaikaisesti (ks. kuva 8). Kokeissa, joissa hiililähteinä käytettiin alaniinia ja etanolia, tuotettiin asetyyli-CoA:ta, jolla oli kaksi erilaista merkintätapaa (Cohen, 1987b). Alaniinin tullessa TCA-kiertoon PDH-reaktion kautta muodostuu asetyyli-CoA:ta ja etanolista saadaan asetyyli-CoA:ta. Sen lisäksi, että asetyyli-CoA:n sisällyttäminen merkitsee sitraattia, α-ketoglutaraattia, glutamaattia ja glutamiinia C4- ja C5-asemissa, se synnyttää tyypillisiä spin-kytkentöjä glutamaatin ja glutamiinin C4- ja C5-hiilivetyjen naapurihiilivetyjen välille, jotka ovat helposti erotettavissa alaniinin sisällyttämisen synnyttämistä singlettiresonansseista. Näin ollen suora arvio alaniinin ja etanolin välisestä kilpailusta voidaan saada analysoimalla glutamaatin C4:n singlettien ja multipleettien suhdetta. Spin-kytkentäkuvioiden analyysi oli hyödyllinen myös perfusoidusta maksasta saaduissa 13C-MR-spektreissä havaittujen glutationista peräisin olevien resonanssien määrittämisessä (Cohen, 1987a). Glutationin glutamyyliosan spin-kytkentäkuviot, jotka havaittiin maksan perfuusiossa 13C-merkityillä esiasteilla, vastasivat läheisesti glutamaatissa havaittua merkintäkuviota. Näin ollen pääteltiin, että glutamaatin hiilirunko säilyi koskemattomana ja sisällytettiin suoraan de novo syntetisoituun glutationiin. Maksan PCA-uutteista mitatut kemialliset siirtymät osoittivat, että glutationi esiintyy pelkistyneessä muodossaan.
Glutamaatin lisäksi monissa kokeissa havaittiin maksan glutamiinin leimautumista. Tämä ei ole yllättävää, koska glutamiinia muodostuu helposti glutamiinisyntaasireaktiossa. Cohen ym. (1979b) seurasivat leiman sisällyttämisen aikakulkua maksan glutamaattiin ja glutamiiniin hiiren maksoissa, jotka perfusoitiin alaniinin ja leimatun tai leimaamattoman etanolin läsnä ollessa. Kaikissa tutkituissa olosuhteissa glutamiinin rikastuminen jäi jälkeen glutamaatin rikastumisesta, mikä käy ilmi glutamaatin ja glutamiinin 13C-MR-signaalin intensiteettien suhteesta C4/C2. Glutamiinissa tiettynä ajankohtana havaittu C4/C2-suhde ei ollut sama kuin vastaava suhde glutamaatissa, vaan se heijasti glutamaatin suhdetta noin 1 tuntia aikaisemmin. Tätä aikaeroa käytettiin mittaamaan allosterisesti kontrolloidun glutamiinisyntaasireaktion läpi kulkevaa virtausta in vivo. Samanlaisia tuloksia saatiin rotan maksasta, joka oli perfusoitu asetaatilla (Desmoulin et al., 1985; Canioni et al., 1985). Glutamaatin ja glutamiinin merkintöjen tulkinta vietiin kuitenkin askeleen pidemmälle. Kirjoittajat ehdottivat, että glutamaatti ja glutamiini saattaisivat osallistua turhaan kiertoon, joka käsittää sytosolisen glutamiinisyntaasin, mitokondriaalisen glutaminaasin ja glutamaatin/glutamiinin vaihdon mitokondriokalvojen läpi.
Alaniinilla ja etanolilla tai pyruviatilla, ammoniumkloridilla ja etanolilla perfusoidussa paastoisessa maksassa voitiin havaita C2:ssa ja C3:ssa leimattua aspartaattia ja N-karbamoylaaspartaattia (Cohen, 1987a). Merkityn aspartaatin havaitseminen ei ole odottamatonta, koska sitä muodostuu helposti TCA-syklin välituotteen oksaloasetaatin transaminaatiosta. N-karbamoylaaspartaattia tuotetaan kuitenkin maksassa yhdessä de novo -pyrimidiininukleotidisynteesin ensimmäisistä vaiheista. N-karbamoylaaspartaatti sisältää ehjän aspartaattiosan, mikä johtaa havaittuun merkintätapaan. 13C-leiman havaitseminen edelleen reitin lopputuotteissa, kuten uridiinissa ja sen fosforylaatiotuotteissa, osoittaa, että perfusoidussa maksassa havaittiin N-karbamoylaaspartaatin nettosynteesiä eikä liikevaihtoa (Cohen, 1987a).