La fluorescence est l’un des outils les plus importants et les plus utiles de la boîte à outils d’un biologiste. En biologie, presque tous les domaines, de la physiologie à l’immunologie, utilisent des molécules fluorescentes (alias fluorophores) pour détecter les protéines. Cependant, la science spécifique derrière le fonctionnement de la fluorescence peut être confuse ou négligée.
Ne craignez rien ! Dans cet article, nous décomposons les points clés de la fluorescence afin que vous puissiez devenir l’expert que vous avez toujours voulu être.
Qu’est-ce que la fluorescence exactement ?
Par définition, la fluorescence est un type de photoluminescence, c’est-à-dire ce qui se passe lorsqu’une molécule est excitée par des photons de lumière ultraviolette ou visible. Plus précisément, la fluorescence est le résultat d’une molécule qui absorbe la lumière à une longueur d’onde spécifique et émet de la lumière à une longueur d’onde plus grande.
Détails, s’il vous plaît
Heureusement, c’est à ce sujet que le Dr Aleksander Jablonski a consacré sa vie. Il a finalement développé le diagramme de Jablonski pour décrire l’absorption et l’émission de la lumière. En bref, les 3 étapes de la fluorescence sont l’absorption (ou excitation), la transition non radiative (ou durée de vie de l’état excité) et l’émission de fluorescence.1
Figure 1. Diagramme de Jablonski. S0 et S1 représentent des états électroniques différents. Les autres chiffres (ici 0-3) représentent des états vibrationnels. Courtoisie de Jacobkhed.
Étape 1 : l’excitation
Retour en arrière en chimie générale : la lumière visible existe sous forme de particules élémentaires appelées photons. Ces particules sont des paquets d’énergie essentiels qui, lorsqu’ils sont absorbés, vont propulser ou « exciter » la molécule absorbant la lumière vers un niveau d’énergie plus élevé. Dans le cas de la fluorescence, les fluorophores absorbent la lumière visible, généralement fournie par une lampe à incandescence ou un laser, ce qui conduit à un état singulet électronique excité (S1) de la molécule.
Étape 2 : Durée de vie de l’état excité
Comme nous le savons tous, le but d’un atome est d’être dans l’état énergétique le plus bas possible. Ainsi, lorsqu’un fluorophore est excité vers un état électronique supérieur, il veut immédiatement commencer à libérer de l’énergie ; ainsi, cet état excité, connu sous le nom de durée de vie de l’état excité, ne dure pas très longtemps (généralement 1 à 10 nanosecondes). Malgré cela, cette étape du processus est incroyablement importante, car c’est pendant ce temps que l’énergie de S1 commence à décroître vers un état excité singulet « relaxé » d’où provient l’émission de fluorescence.
Étape 3 : émission
Et enfin, nous sommes prêts pour de la fluorescence ! En partant de l’état excité « relaxé », le photon à haute énergie se désintègre rapidement vers l’état fondamental et émet cet excès d’énergie sous forme de photon de lumière. Cette transition d’énergie est ce que nous appelons la fluorescence. Il est intéressant de noter que, comme une partie de cette énergie a déjà été libérée pendant la durée de vie de l’état excité, l’énergie du photon qui devient fluorescent est inférieure à l’énergie du photon d’excitation. Ainsi, l’énergie libérée pendant la fluorescence sera toujours d’une longueur d’onde plus grande que celle nécessaire à l’excitation.
Comment la cytométrie en flux tire-t-elle parti des molécules fluorescentes ?
Nous avons couvert le concept et les bases de la cytométrie en flux dans des articles précédents et un webinaire, alors revenez en arrière et rafraîchissez le sujet si vous en avez besoin.
Prêts ? C’est parti !
Lorsque nous traitons des molécules fluorescentes, nous devons accorder une attention particulière à la différence entre les longueurs d’onde ou l’énergie d’excitation et d’émission, autrement connue sous le nom de décalage de Stokes. L’importance du décalage de Stokes réside dans sa simplicité : il nous permet de déterminer si la longueur d’onde de la lumière émise et la longueur d’onde de la lumière excitatrice sont suffisamment grandes pour les distinguer de manière fiable. La lecture de la cytométrie en flux étant basée uniquement sur la fluorescence, il est essentiel de connaître ce paramètre, sous peine de générer des données peu fiables, en emoji caca.
De plus, il est extrêmement important de garder une trace du spectre d’absorption et du spectre d’émission pour chaque fluorophore, et de la façon dont les différents lasers peuvent interagir avec le fluorophore en question. Par exemple, dans une machine de cytométrie de flux, le laser à ions argon émet une lumière de 488 nm qui excite le fluorophore, l’isothiocyanate de fluorescéine (FITC). Comme le 488-nm est très proche du maximum d’absorption du FITC, l’excitation entraîne une forte émission de FITC. Cependant, si le FITC est excité par une autre longueur d’onde provenant d’un laser différent dans son spectre d’absorption, il émet de la lumière dans le même spectre, mais elle n’est pas de la même intensité.
Et voilà : une rapide introduction/rappel de la fluorescence et de son lien avec les molécules fluorescentes utilisées en cytométrie de flux. Des questions ? Des commentaires ? Faites-le nous savoir !