5.5.9 The Tricarboxylic Acid Cycle
Pyruvate is at the branch point of the catabolic sequence of oxidative glucose metabolism in the TCA cycle and the gluconeogenic pathway from C3 precursors. In beide routes komt pyruvaat in de TCA-cyclus terecht waar het ofwel via pyruvaatdehydrogenase oxidatief wordt gedecarboxyleerd tot acetyl-CoA ofwel in de pyruvaatcarboxylase-reactie wordt gecarboxyleerd tot oxaloacetaat. Aangezien PC en PDH concurreren om pyruvaat, nemen zij een sleutelpositie in voor de regulering van respectievelijk het anaplerotische (d.w.z. aanvullende) en het oxidatieve metabolisme. Cohen en medewerkers (1979b; Cohen, 1983, 1987a,b,c) gebruikten combinaties van gelabeld en ongelabeld alanine of pyruvaat, en ethanol om de hepatische substraatconcurrentie te onderzoeken voor toegang tot de TCA-cyclus onder verschillende hormonale en voedingstoestanden van geperfundeerde ratten- en muizenlevers.
Wanneer alanine het enige hepatische substraat was, werden C2, C3, en C4 van glutamaat en glutamine gemakkelijk gelabeld, zoals verwacht uit de topologie van de TCA-cyclus (Cohen et al., 1979b; Cohen, 1987a). Het alanine wordt getransamineerd tot pyruvaat, dat ofwel gedecarboxyleerd wordt tot acetyl-CoA of gecarboxyleerd tot oxaloacetaat. Het acetyl-CoA wordt omgezet in citraat en vervolgens in α-ketoglutaraat, dat op zijn beurt kan worden omgezet in glutamaat. Anderzijds is oxaalacetaat in evenwicht met malaat en fumaraat (zie paragraaf 5.5.8) en het label wordt geklutst in C2 en C3 van oxaalacetaat. Condensatie van dergelijke oxaloacetaatisotopomeren met acetyl-CoA in de citraat synthase reactie geeft vervolgens aanleiding tot – en α-ketoglutaraat en dus tot – en glutamaat. Het relatieve aandeel van pyruvaat dat via PC en PDH in de TCA-cyclus terechtkomt, kan dus worden geschat aan de hand van de relatieve verrijkingen in glutamaat C2 en C4. Onder de aanname van een eerste-orde model waarbij slechts één draai van de TCA-cyclus wordt beschouwd en continue recycling van label wordt verwaarloosd (zie paragraaf 5.3.7), berekende Cohen (1983, 1987c) verhoudingen van PC versus PDH flux rate die varieerden van 1,2 tot 2,6 en 7,7 in levers van goed gevoede, diabetische en 24-hasted donorratten, respectievelijk. In diabetische lever, werd het relatieve aandeel van pyruvaat gekanaliseerd in de TCA-cyclus via de twee alternatieve routes niet veranderd door de in vitro incubatie met insuline.
In tegenstelling tot experimenten waarbij alanine was het enige substraat voor levermetabolisme, coadditie van ongelabelde ethanol resulteerde in glutamaat C4 en glutamine C4 in wezen verstoken van label (Cohen et al., 1979b). Ethanol, dat gemakkelijk door alcoholdehydrogenase wordt geoxideerd tot acetaldehyde en dan verder tot acetaat, dient als een extra bron voor acetyl-CoA. Uit de resultaten bleek dat acetyl-CoA afkomstig van ethanol efficiënt concurreert met acetyl-CoA dat via PDH de TCA-cyclus binnenkomt. In aanwezigheid van een alternatieve bron van acetyl-CoA kwam alanine dus bijna uitsluitend via de PC-reactie in de TCA-cyclus terecht. Bovendien verhoogde gelijktijdige toediening van alanine met ethanol de snelheid van alanineconsumptie via de PC-reactie met bijna 50% vergeleken met levers die alleen met alanine waren toegediend. Dit resultaat is niet onverwacht in het licht van een PC-reactie die wordt gereguleerd door het niveau van acetyl-CoA. Een verhoogde concentratie acetyl-CoA, zoals beschikbaar was door het metabolisme van ethanol, verhoogde de flux door PC om de oxaloacetaatpool te vergroten voor een versnelde consumptie van acetyl-CoA in de TCA-cyclus. Vergelijkbare experimenten met gelabeld pyruvaat + NH4C1 en ethanol als substraten werden uitgevoerd en leverden gelijkwaardige resultaten op (Cohen, 1987a,b). Bovendien gebruikten Nedelec et al. (1990b) het model voorgesteld door Cohen (1983) voor de beoordeling van het effect van virus-geïnduceerde myeloproliferatieve leukemie op het levermetabolisme. Het alaninemetabolisme in geïnfecteerde levers van nuchtere donoren bleek vergelijkbaar te zijn met dat van gevoede controles. De levers van beide groepen hadden een verminderde bijdrage van PC versus PDH aan de flux van alanine in de TCA-cyclus in vergelijking met nuchtere controles. De veranderde verhouding van PC/PDH flux in leukemische nuchtere levers werd verklaard door de drastisch verminderde beschikbaarheid van triglyceriden en dus acetyl-CoA in deze organen.
13C MRS biedt de unieke mogelijkheid van het volgen van het metabolisme van ethanol en alanine tegelijk (zie figuur 8). In experimenten waarbij alanine en ethanol als koolstofbronnen werden gebruikt, werd acetyl-CoA met twee verschillende etiketteringspatronen geproduceerd (Cohen, 1987b). Bij binnenkomst van alanine in de TCA-cyclus via de PDH-reactie wordt acetyl-CoA gevormd en acetyl-CoA wordt afgeleid van ethanol. Naast het labelen van citraat, α-ketoglutaraat, glutamaat en glutamine op posities C4 en C5, geeft de incorporatie van acetyl-CoA aanleiding tot typische spin koppelingen tussen de naburige koolwaterstoffen C4 en C5 van glutamaat en glutamine, die gemakkelijk te onderscheiden zijn van de singlet resonanties gegenereerd door de incorporatie van alanine. Vandaar dat een directe schatting voor de competitie tussen alanine en ethanol kan worden verkregen uit de analyse van de singlet-tot-multiplet verhouding in C4 van glutamaat. De analyse van spin-coupling patronen was ook nuttig voor de toewijzing van resonanties van glutathion waargenomen in 13C MR spectra verkregen uit geperfundeerde levers (Cohen, 1987a). De spin-koppelingspatronen die voor het glutamylgedeelte in glutathion op leverperfusie met 13C-gelabelde precursors worden ontdekt stemden dicht met het etiketteringspatroon overeen dat in glutamaat wordt waargenomen. Aldus werd geconcludeerd dat het koolstofskelet van glutamaat intact bleef en direct werd opgenomen in de novo gesynthetiseerde glutathion. Chemische verschuivingen gemeten in PCA extracten van levers gaven aan dat glutathion aanwezig is in zijn gereduceerde vorm.
Afgezien van glutamaat, werd labeling van lever glutamine waargenomen in vele experimenten. Dit is niet verwonderlijk omdat glutamine gemakkelijk wordt gevormd in de glutamine synthase reactie. Cohen et al. (1979b) volgden het tijdsverloop van de labelintegratie in leverglutamaat en glutamine in muizenlevers die werden geperfundeerd in aanwezigheid van alanine en gelabelde of ongelabelde ethanol. Onder alle onderzochte omstandigheden, de verrijking in glutamine achtergebleven bij die van glutamaat zoals blijkt uit de verhouding C4 / C2 van de 13C MR-signaal intensiteiten in glutamaat en glutamine, respectievelijk. De C4/C2 verhouding die op een bepaald tijdstip in glutamine werd waargenomen was niet dezelfde als de overeenkomstige verhouding in glutamaat, maar weerspiegelde in plaats daarvan de glutamaatverhouding van ongeveer 1 uur eerder. Dit tijdsverschil werd gebruikt als een maat voor de flux door de allosterisch gecontroleerde glutamine synthase reactie in vivo. Vergelijkbare resultaten werden verkregen met rattenlevers die met acetaat waren doorbloed (Desmoulin et al., 1985; Canioni et al., 1985). De interpretatie van de etikettering in glutamaat en glutamine werd echter een stap verder gebracht. De auteurs suggereerden dat glutamaat en glutamine deel zouden kunnen nemen aan een nutteloze cyclus, die de activiteiten omvat van cytosolische glutamine synthase, mitochondriale glutaminase, en glutamaat/glutamine uitwisseling over de mitochondriale membranen.
In nuchtere levers die met alanine en ethanol of met pyruvaat, ammoniumchloride en ethanol werden doorbloed, konden aspartaat en N-carbamoylaspartaat, gelabeld bij C2 en C3, worden waargenomen (Cohen, 1987a). De detectie van gelabeld aspartaat is niet onverwacht omdat het gemakkelijk wordt gevormd door de transaminering van het tussenproduct in de TCA-cyclus oxaloacetaat. N-carbamoylaspartaat wordt echter in de lever geproduceerd in een van de eerste stappen van de de novo pyrimidine nucleotide synthese. N-carbamoylaspartaat integreert het intacte aspartaatgedeelte, hetgeen leidt tot het waargenomen etiketteringspatroon. De verdere detectie van 13C-labels in de eindproducten van de route, zoals uridine en zijn fosforylatieproducten, geeft aan dat een netto-synthese van N-carbamoylaspartaat, in tegenstelling tot turnover, werd waargenomen in geperfundeerde levers (Cohen, 1987a).