Re-epitelialisation: advancing epithelium frontier during wound healing

Zaniedbując wzrost objętościowy (γ = 0) w tkance z wyjątkiem peryferii, gęstość komórek jest stała i ρ = ρ0. Równanie (2.1) upraszcza się do i daje, że normalna prędkość frontu jest wprost proporcjonalna do normalnego gradientu stężenia. Przy ekstremalnie małych prędkościach migracja komórek spełnia prawo Darcy’ego , gdzie Mp jest współczynnikiem porowatości równym kwadratowi wysokości nabłonka podzielonemu przez współczynnik tarcia. Jak pokazano w , prawo to jest wydedukowane w tkankach, gdy tarcie między fazami lub tarcie o podłoże równoważy hydrostatyczną część naprężeń sprężystych działających na komórki. Rana zaburza stan homoeostazy otoczenia i źródło morfogenów będzie próbowało przywrócić optymalną wartość równowagi w szczelinie c0. Przyjmując to stężenie jako jednostkę stężenia morfogenu (co daje ), τc czas wchłaniania jako jednostki czasu, Le jako jednostkę długości (gdzie , De jest współczynnikiem dyfuzji wewnątrz nabłonka), otrzymujemy

2,2

z indeksem h lub e odnoszącym się do domeny wewnętrznej (otwór) lub zewnętrznej (nabłonek). δ = Dh/De reprezentuje stosunek współczynnika dyfuzji w otworze Dh do tkanki De, jest on większy od 1, a α podaje siłę strumienia poprzecznego, który utrzymuje poziom morfogenu wewnątrz otworu. Ze względu na względną powolność migracji komórek, w równaniu (2.2) pomijamy zależność od czasu. Przyjęcie De/Mp jako jednostki ciśnienia upraszcza prawo Darcy’ego do postaci , gdzie dla uproszczenia zachowujemy tę samą notację dla p i v. Z równania bilansu masy (2.1) otrzymujemy następujące równanie Laplace’a sprzęgające nieznane ciśnienie p z koncentracją chemoatraktanta c:

2.3

Otrzymujemy więc , gdzie ϕ jest funkcją holomorficzną spełniającą Δϕ = 0. Na koniec musimy zwrócić szczególną uwagę na warunki brzegowe interfejsu. Dla równania (2.2) dotyczą one ciągłości koncentracji i nieciągłości strumienia z powodu zużycia morfogenu przez mitozę na granicy (dla demonstracji, patrz ):

2.4

gdzie N jest normalną zewnętrzną. Γ2 jest tempem absorpcji ograniczonym na granicy omówionej poniżej wraz z tempami mitozy Γ1 i na granicy. Kapilarność utrwala skok ciśnienia na granicy

2.5

, co daje warunek swobodnej granicy z uwzględnieniem efektu geometrycznego, gdzie jest lokalnym promieniem krzywizny. jest równy promieniowi, jeśli geometria jest okręgiem. Rozważa on jednak efekt lokalny w małej skali długości, gdy granica jest zaburzona. Jednocześnie prędkość interfejsu różni się od prędkości nabłonka v przez proliferację komórek na granicy i otrzymujemy

2.6

gdzie Γ1 jest tempem mitozy, a σ liczbą kapilar związaną z napięciem T na granicy, więc Gojenie ran in vivo jest zdominowane przez dwuwymiarową migrację, a morfogenami prawdopodobnie nie są składniki odżywcze, więc Γ2 znika, a Γ1c musi być zastąpione przez , jeśli rozważamy również mitozę bez ilościowego wpływu stężeń składników odżywczych. Liczba kapilar σ może być związana z aktywnością przewodu aktynowego (wiązki mikrofilamentów) w komórkach. Podczas gojenia ran embrionalnych, komórki brzegu wiod±cego mog± globalnie koordynować swoje przewody aktynowe, co generuje efekt na poziomie makroskopowym. Jednakże, to skoordynowane zachowanie jest tracone u dorosłych, więc efekt kabli aktynowych może działać tylko lokalnie. Przypomina to σ w naszym modelu, które nie jest efektywne dla dużych ran. Rozważając układ równań (2.2) i (2.3) w połączeniu z zestawem warunków brzegowych (2.4), (2.5) i (2.6) pokazujemy, że migracja napędzana chemotaksją jest w istocie problemem o swobodnych granicach, obejmującym kilka parametrów reprezentujących złożoność biologiczną, a badanie prostych przypadków, na przykład okrągłego zamknięcia, może pomóc w zrozumieniu ich roli. Przedstawiamy więc najpierw wyniki analityczne dla otworu pozostającego kolistym przez cały czas, a następnie jego stabilność.

Wyniki

3.1. Regularne zamknięcie kołowe

W przybliżeniu quasi-statycznym równanie (2.2) może być rozwiązane analitycznie i daje

3.1

I0 (resp. K0) będące zmodyfikowaną funkcją Bessela zerowego rzędu, regularną w punkcie r = 0 (resp. r → ∞). Równanie (3.1) uwzględnia ciągłość na granicy faz, przy czym A jest dane ciągłością strumienia i ma postać

3.2

z następującą definicją dla (stosunek dwóch kolejnych funkcji Bessela) i równoważną dla Ciśnienie P0 wewnątrz nabłonka staje się

3.3

Wykorzystujemy prawo Laplace’a do ustalenia nieznanego stopnia swobody. Holomorficzna funkcja ϕ, proporcjonalna do log(r), reprezentuje możliwą siłę napędową, która pojawia się na interfejsie (tj. tzw. kenotaksja zdefiniowana w ). Rzeczywiście, nawet przy braku morfogenów obserwuje się migrację nabłonka in vitro na stałym podłożu, być może dzięki reorganizacji cytoszkieletu komórkowego na granicy rany. Zauważmy, że model pozostaje poprawny, je¶li odrzucimy chemotaksję, pod warunkiem, że zmienimy definicję jednostek długo¶ci i czasu. Ponadto, C0 i P0 są zależne od czasu poprzez R(t). Dla uproszczenia, porzucamy zależność od czasu Prędkość zamknięcia wydedukowana z równania (3.5) wynosi wtedy

3.4

Prędkość zamykania jest stała dla dużych otworów i jest wykładniczo mała , gdy promień R staje się maleńki, jeśli ograniczyć się do migracji chemotatycznej i proliferacji. Tak więc promień dużego otworu zaczyna się od liniowego spadku w czasie, ale całkowite zamknięcie zajmie nieskończony czas na całkowite osiągnięcie. Dla małych otworów, chemotaksja staje się subdominująca w porównaniu z kenotaksją Ain na interfejsie, która kontroluje dynamikę zamykania, a promień spełnia dyfuzyjne prawo w t1/2 . Rysunek 3 przedstawia w funkcji R dla różnych wartości α, δ i Ain/Λ, a §4 zawiera dyskusję parametrów.

3.2. Utrata okrągłości

Jednakże równanie (3.4) jest ważne tylko wtedy, gdy zachowany jest kontur kołowy. Dlatego przeprowadzamy liniową analizę stabilności dla dużych ran (Ain ∼ 0) zakładając małą harmoniczną perturbację dla promienia jako wywołującą zmiany na ciśnieniu P i polu koncentracji C tego samego rzędu ε w następujący sposób:

3.5

gdzie indeks dolny i oznacza albo wielkość względem otworu (h, 0 < r < R) albo względem naskórka (e, R < r < ∞). Chociaż wszystkie wielkości perturbacyjne zależą od wybranego trybu n, to liniowa analiza perturbacyjna traktuje te tryby niezależnie. Porzucamy więc indeks n i obliczamy perturbacyjne pola koncentracji ci(r) z równania (2.3)

3.6

natomiast perturbacyjne pole ciśnienia jest dane przez gdzie uwzględniamy tryby harmoniczne funkcji holomorficznej ϕ z B ustalonym prawem Laplace’a Dzięki słabości ε nasz układ równań, po linearyzacji, można rozwiązać analitycznie, a szybkość wzrostu trybu n odczytujemy

3.7

gdzie

Równanie (3.7) przedstawia zależność implicite dla Ωn, rozwiązywaną za pomocą technik iteracyjnych, a wartości dodatnie wskazują na tryby odpowiedzialne za destabilizację granicy kołowej w miarę postępu migracji. Wyniki są przedstawione dla różnych wartości Λ, α i δ, gdzie Ωn jest pokazane na rysunku 4. Dyskusja parametrów znajduje się w §4. Wyniki wskazują na niestabilność prowadzącą do odchylenia od okręgu w krótkim czasie, dla n aż do trybu krytycznego nc (ustalonego przez kapilarność). Dlatego symulacje numeryczne są niezbędne, aby wyjść poza analizę liniową i w pełni rozważyć nieliniowości.

3.3. Pełna dynamika i metody numeryczne

Dyskretyzujemy c w równaniu (2.2) i ciśnienie p w równaniu (2.3) na siatce kartezjańskiej w przestrzeni i implicite w czasie, używając nieliniowej adaptacyjnej metody iteracyjnej Gaussa-Seidela. Na granicy domeny narzucamy zarówno znikające wartości c, jak i normalny gradient p. Następnie szum jest dodawany na C = c + χ z Zaczynając od idealnego okręgu z R = 90, zamykanie rany jest śledzone przez metodę level-set opracowaną w gdzie funkcja skalarna Φ z opisuje ranę (Φ < 0), nabłonek (Φ > 0) i interfejs (Φ = 0). Normalna i krzywizna w równaniu (2.5) są obliczane za pomocą standardowej geometrii różniczkowej: i Φ jest aktualizowane przez zależność , gdzie Vext jest stałym rozszerzeniem Vint na interfejsie z równania (2.5) po gradiencie Zauważmy, że ta metoda symuluje idealne zamknięcie kołowe bez szumu. Zgodnie z naszymi wynikami, rana odchyla się od idealnego okręgu wkrótce po wzroście, jak pokazano na rysunkach 5 i 6 i w zgodzie z analizą stabilności.

Dyskusja i wnioski

W tym modelu jest kilka niezależnych parametrów. Niektóre z nich możemy ustalić z opublikowanymi danymi eksperymentalnymi (tabela 1). Nasza jednostka prędkości jest zgodna z prędkością zamykania rogówki (3 dni dla otworu o promieniu około 3 mm ) dając Λ ∼ 1 dla tego eksperymentu zgodnie z równaniem (3.2). Na rysunku 4 zmieniamy parametry α i δ, które są trudniejsze do oszacowania, a także Λ. Ze względu na duże rozmiary ran w praktyce, analiza stabilności liniowej daje zawsze niestabilność i wniosek ten jest odporny na zmiany parametrów. Wniosek ten potwierdzają w pełni nieliniowe symulacje w tym samym zakresie parametrów (rys. 5 i 6). W symulacjach, duże Λ (ok. 10, całkowity czas ok. 60) przyczynia się do szybszego zamykania w porównaniu z małym Λ (ok. 1, całkowity czas ok. 600). Typowy przykład procesu zamykania przy α = 1 i δ = 2 pokazano na rysunku 5a. Postępujący interfejs staje się falisty w miarę gojenia się rany; jednakże, gdy rana staje się mała, napięcie powierzchniowe ponownie stabilizuje ranę do kształtu ziemniaka, zgodnie z liniową analizą stabilności. To napięcie powierzchniowe może również odciąć ranę na mniejsze kawałki, jak pokazano na rysunku 5b(ii), rysunku 6 i w . To zdarzenie wymaga najpierw bardziej nieregularnego zamykania (czerwone strzałki na rycinie 6), kiedy stężenie chemoatraktantów jest mniej jednorodne, biorąc pod uwagę nieodpowiedni strumień poprzeczny (α = 0.1). Uszczypnięcie może nastąpić zarówno na pośrednim jak i końcowym etapie zamykania (żółte strzałki), co jest zgodne z obserwacjami na późnym etapie gojenia się rany na monowarstwie komórek MDCK (rysunek 6, po prawej), sugerując takie samo zachowanie w bardziej złożonych procesach gojenia się ran.

W niniejszej pracy wykazaliśmy teoretycznie, że reepitelializacja rany daje niestabilność graniczną przy klinicznie realistycznych parametrach. Nasz model, napędzany przez chemotaksję, nie wprowadza innych aktywności komórek, które zamykają ranę na etapie końcowym. Przypuszczamy jednak, że ta chemotaktyczna niestabilność na granicy rany może wpływać na jakość ostatecznej naprawy. Podczas gojenia się ran embrionalnych, gdzie obserwuje się doskonałą rekonstrukcję, rana jest zamykana przez „sznurek strunowy”, który reprezentuje koordynację komórek brzegu wiodącego ułatwioną przez kabel aktyny . Mechanizm ten jest utracony w skórze dorosłej, gdzie rana zamykana jest przez pełzanie komórek (kilka warstw) po tkance ziarninowej. W porównaniu ze statycznym podłożem in vitro, tkanka ziarninowa ulega skurczeniu pod koniec reepitelializacji przez miofibroblasty. Rzeczywiście, celem tego jest zbliżenie krawędzi, co przypomina „sznurek do snopowiązałki”, ale skurcz tych komórek musi być zgodny z synchroniczną konstytucją materiału, co jest mechanicznie i systematycznie wyzwaniem .

Na koniec omawiamy nasz model w kontekście gojenia się rany skóry in vivo. Gdy rana sięga głęboko do skóry właściwej, co ma miejsce w przypadku większości ran, obie warstwy zachowują się inaczej podczas reepitelializacji. Głębokość rany wpływa na grubość dolnej warstwy, w której uwalniany jest chemoatraktant. Biorąc pod uwagę reepitelializację, gdzie tylko kilka warstw komórek staje się ruchliwych powyżej dolnych stosów, gdzie chemoatraktant jest uwalniany, głębokość rany przyczynia się matematycznie do siły poprzecznego strumienia chemoatraktantu α. Oprócz α, która może obejmować głębokość rany, geometria, rozmiar rany, jak również współczynnik dyfuzji δ są brane pod uwagę. W porównaniu z eksperymentami in vivo, proces gojenia się ran u ludzi może różnić się od tego u myszy doświadczalnych ze względu na inne właściwości biomechaniczne skóry. Jednakże, jeśli zamierzamy rozważyć problem in vivo z uwzględnieniem bioelastyczności, wyzwaniem nie są tylko różne składniki obu warstw, ale również fakt, że połączenie pomiędzy warstwą skórną i naskórkową jest wysoce nieuporządkowane nawet dla nienaruszonej skóry, jak pokazano w naszej poprzedniej pracy. Regularny wzór powinien być zdefiniowany w trzecim wymiarze, który uważamy za „normalny”. Ponadto, ponieważ tkanka rany ulega przebudowie podczas gojenia, parametry mechaniczne nie mogą być traktowane jako stałe, a relaksacja tkanki prawdopodobnie rozwija się w większej skali czasowej niż reepitelializacja. Istotnie, te procesy relaksacji powinny być również brane pod uwagę w przewidywaniu jakości ostatecznej naprawy. Zanim to nastąpi, nieregularność granicy rany napędzana przez chemotaksję powinna być rozważana jako składnik.

Oświadczenie o finansowaniu

Ta praca była wspierana częściowo przez AAP Physique Cancer 2012.

Przypisy

.