Re-epitelização: avanço da fronteira do epitélio durante a cicatrização de feridas

Introdução

Pele adulta é composta por três camadas: a epiderme e a derme separadas pela membrana do porão. Quando ocorre uma lesão profunda que destrói uma parte da derme, esta tem de ser reparada rapidamente para restaurar a barreira protectora. A cicatrização de feridas in vivo é um processo de reparação complexo orquestrado por vias intra e intercelulares. Para recuperar a integridade da pele, este processo é realizado por quatro etapas sucessivas mas sobrepostas: coagulação, inflamação, reepitelização e remodelação. Imediatamente após uma lesão, forma-se um coágulo composto principalmente por fibras de fibrina e plaquetas para tamponar a ferida (fase 1). Posteriormente, nos próximos 2-10 dias (fase 2), o coágulo é continuamente infiltrado por células inflamatórias que limpam os detritos e libertam factores químicos, tais como o factor de crescimento endotelial vascular e o factor de crescimento transformador – beta. Uma vez estabelecido o gradiente químico, diferentes células são recrutadas para fabricar o novo tecido (estágio 3). Por um lado, neovasculatura e fibroblastos (depositando colágeno) são recrutados na derme, reformando o coágulo em um tecido de granulação, que nutritiva e fisicamente suporta a reparação das camadas superiores. Por outro lado, os queratinócitos migram e proliferam na borda da ferida para estender o tapete epitelial recém formado, feito de várias camadas de células da epiderme. Este processo chama-se reepitelização e dura de duas a três semanas. No final da fase 3, os miofibroblastos transformados de fibroblastos contraem-se e tentam juntar a borda da ferida. Eles desaparecem por apoptose na derme. A remodelação (fase 4) continua durante meses ou mesmo anos, a fim de restaurar a homeostase da pele normal. Entretanto, a estrutura anatômica normal não é verdadeiramente recuperada e uma cicatriz é formada a partir do tecido de granulação. Embora isto seja verdade para feridas grandes em humanos adultos, as de embriões humanos podem estar perfeitamente fechadas, não sendo as razões completamente compreendidas. Curiosamente, acredita-se que a formação da cicatriz é um sacrifício evolutivo para se conseguir um fecho rápido da ferida e isto é indicado pela resposta inflamatória intensa e redundante que medeia os comportamentos celulares sistemáticos durante a reepitelização através da libertação de sinais químicos. Em todos os casos, a cicatriz final é um resultado da interação entre as células e o microambiente através de fatores físicos e químicos durante os quatro estágios.

Aqui, nós focamos na reepitelização quando os queratinócitos, as células predominantes da epiderme, se destacam da membrana basal, migram em direção à margem da ferida e proliferam, impulsionados por morfógenos no tecido de granulação. Experiências muito cuidadosas de migração do epitélio in vitro têm sido realizadas recentemente por vários grupos . Realizadas em um substrato sólido, elas envolvem um monocamada em avanço motivado pelo comportamento coletivo das células através da migração, geração de forças e reorganização do citoesqueleto celular na margem. Os resultados indicam uma forma não-intuitiva das células para alcançar robustez durante o reparo, onde a quimiotaxia parece não ser decisiva para a migração celular global in vitro. No entanto, devido à abundância de sinais morfogénicos libertados na ferida in vivo em comparação com experiências in vitro, a quimiotaxia domina o comportamento colectivo das células durante o processo de cicatrização da ferida. Mais perto da cicatrização da ferida in vivo (figura 1a(i)(ii)), foi reconstituída uma córnea artificial (figura 1b(i)(ii)) através da introdução de células epiteliais, fibroblastos e factores de crescimento numa placa de Petri tridimensional. Curiosamente, todos estes trabalhos dizem respeito à geometria circular e não ao corte linear feito em experiências anteriores. Embora bem controlados, não é claro que estes sistemas apresentem toda a complexidade da cicatrização de feridas in vivo . No entanto, tanto as experiências in vivo como as in vitro apresentam uma evolução desordenada da fronteira, o que indica uma possível irregularidade universal devido à quimiotaxia (figura 1).

>

Neste trabalho, descrevemos a reepitelização considerando um orifício circular em um tecido, adaptando um modelo dinâmico recente de migração quimiotáxica impulsionada por gradientes morfogenéticos. Sendo contínuo, o modelo descreve o tecido em uma escala maior que o tamanho da célula, mas menor que o tamanho do furo. Aqui, não distinguimos as espécies celulares ou as categorias de quimiotraxantes. Esta última é continuamente fornecida por um fluxo de entrada da terceira dimensão normal para a camada epitelial e subtraída pelos receptores celulares. Como mostrado em , a finura da camada móvel transforma o processo tridimensional em um modelo bidimensional, onde a variação de espessura localizada na borda contribui para uma tensão T. Além disso, assumimos que existe um forte atrito viscoso entre a camada móvel e o substrato , o que permite escrever uma lei de Darcy para o campo de velocidade média dentro do tecido, enquanto as interações célula-células e mitose são transformadas em condições de fronteira de interface no limite da interface afiada. Apresentamos primeiro o modelo físico, depois o tratamento analítico dando uma solução explícita para a geometria circular e um estudo da sua estabilidade. De fato, no caso de uma borda linear, foi demonstrado que uma longa instabilidade do comprimento de onda ocorre em baixas velocidades devido a um modo Goldstone (invariância translacional) que a tensão superficial por si só não consegue proibir . Intuitivamente, pode-se esperar que ela desapareça para pequenos furos à medida que o efeito da tensão superficial se acentua. Pelo contrário, como para experiências in vitro, furos maiores podem exibir instabilidades de contorno que levam a comportamentos dinâmicos que pretendemos prever. Para ir além da análise de estabilidade, o problema dos limites livres dependentes do tempo requer métodos numéricos capazes de resolver equações em domínios em evolução. Optamos por resolver o nosso problema através de métodos definidos por níveis, desenvolvidos pela primeira vez nos anos 80 por Osher & Sethian , que são capazes de seguir automaticamente as interfaces em movimento e as alterações topológicas e têm sido aplicados com sucesso a problemas, tais como interacções líquido-gás, processamento de imagem e crescimento de tumores . Devido à natureza do nosso problema teórico, seleccionamos a metodologia desenvolvida para o crescimento do tumor . A seguir, apresentamos primeiro o modelo, introduzindo os parâmetros físicos mais relevantes, depois a análise para a instabilidade de fraca amplitude e, finalmente, métodos numéricos e simulações para o estado final do fechamento.

O modelo

Consideramos um orifício circular Ω numa população celular bidimensional de densidade ρ imersa num ambiente morfogenético (figura 2). As células migram para cima no gradiente morfogênico, sendo o fluxo quimiotático proporcional ao gradiente de concentração de morfógenos , sendo Λc uma constante de mobilidade. A distribuição de morfógenos dentro e fora do orifício Ω é alimentada através de fontes vindas de baixo. A mitose ocorre apenas na borda e o fechamento é conseguido principalmente pela migração. O balanço de massa para a população celular é então

2.1

Neglecting volumetric growth (γ = 0) no tecido exceto na periferia, a densidade celular é constante e ρ = ρ0. A equação (2.1) simplifica para e dá que a velocidade normal da frente é diretamente proporcional ao gradiente normal de concentração. A velocidades extremamente baixas, a migração celular satisfaz uma lei de Darcy , sendo Mp um coeficiente de porosidade igual ao quadrado da altura do epitélio dividido por um coeficiente de fricção. Como mostrado em , esta lei é deduzida nos tecidos quando o atrito entre fases ou o atrito com um substrato equilibra a parte hidrostática da tensão elástica atuando sobre as células . A ferida perturba o estado homeostático do ambiente e uma fonte de morfógenos tentará restaurar um valor de equilíbrio óptimo na abertura c0. Tomando esta concentração como unidade para a concentração de morfógenos (dando ), τc o tempo de absorção como unidades de tempo, Le como unidade de comprimento (com , De sendo o coeficiente de difusão dentro do epitélio), obtemos

2.2

com o índice h ou e referente ao domínio interno (furo) ou externo (epitélio). δ = Dh/De representa a razão entre o coeficiente de difusão no furo Dh e o tecido De, é maior que 1, e α dá a força do fluxo transversal que mantém o nível de morfogênio no interior do furo. Devido à relativa lentidão da migração celular, negligenciamos a dependência do tempo na equação (2.2). Tomando De/Mp como unidade de pressão simplifica a lei de Darcy em, onde por simplicidade mantemos a mesma notação para p e v. Da equação de equilíbrio de massa (2.1), obtemos a seguinte equação de Laplace acoplando a pressão desconhecida p à concentração quimiotrativa c:

2.3

Então, obtemos, onde ϕ é uma função holomórfica que satisfaz Δϕ = 0. Finalmente, devemos prestar especial atenção às condições de limite da interface. Para a equação (2.2), elas dizem respeito à continuidade da concentração e à descontinuidade do fluxo devido ao consumo de morfogênio por mitose na borda(para demonstração, ver ):

2.4

onde N é o normal externo. Γ2 é a taxa de absorção limitada na borda discutida abaixo junto com as taxas de mitose Γ1 ena borda. A capilaridade fixa o salto de pressão na interface

2,5

> o que dá a condição de limite livre considerando o efeito geométrico ondeé o raio de curvatura local.é igual ao raio, se a geometria for um círculo. No entanto, considera o efeito local em pequena escala de comprimento quando o limite é perturbado. Ao mesmo tempo, a velocidadeda interface difere da do epitélio v pela proliferação celular na borda e obtemos

2.6

onde Γ1 é a taxa de mitose e σ o número capilar relacionado com a tensão T na interface entãoA cura da ferida in vivo é dominada pela migração bidimensional e os morfógenos provavelmente não são os nutrientes, então Γ2 desaparece e Γ1c deve ser substituído porse considerarmos também a mitose sem o efeito quantitativo das concentrações de nutrientes. O número capilar σ pode envolver as actividades do cabo de actina (microfilamentos agrupados) nas células. Durante a cicatrização de feridas embrionárias, as células de ponta podem coordenar seus cabos de actina globalmente que geram um efeito no nível macroscópico. No entanto, este comportamento coordenado é perdido em adultos, pelo que o efeito dos cabos de actina pode actuar apenas localmente. Isto assemelha-se a σ no nosso modelo, que não é eficaz para feridas grandes. Considerando o conjunto de equações (2.2) e (2.3) em conjunto com o conjunto de condições limite (2.4), (2.5) e (2.6) mostra que a migração quimiotática é de facto um problema de livre-condição envolvendo vários parâmetros para representar a complexidade biológica e o estudo de casos simples, por exemplo o fecho circular, pode ajudar a compreender os seus papéis correspondentes. Assim, apresentamos primeiro os resultados analíticos de um buraco que permanece sempre circular, depois a sua estabilidade.

Os resultados

3.1. Fechamento circular regular

Na aproximação quase-estática, a equação (2.2) pode ser resolvida analiticamente e dá

3.1

I0 (resp. K0) sendo a função Bessel modificada de ordem zero, regular a r = 0 (resp. r → ∞). A equação (3.1) leva em conta a continuidade na interface, sendo A dada pela continuidade do fluxo e lê

3.2

com a seguinte definição para(relação de duas funções sucessivas de Bessel) e o equivalente paraA pressão P0 no interior do epitélio torna-se

3.3

Usamos a lei de Laplace para fixar o grau de liberdade desconhecido. A função holomórfica ϕ, proporcional ao log(r), representa uma possível força motriz que aparece na interface (isto é, os chamados kenotaxis definidos em ). De facto, mesmo na ausência de morfogénios, observa-se uma migração in vitro do epitélio sobre o substrato sólido, talvez devido à reorganização do citoesqueleto celular na margem da ferida. Note-se que o modelo permanece válido se descartarmos a quimiotaxia desde que a definição de unidades de comprimento e tempo seja modificada. Além disso, C0 e P0 são dependentes do tempo via R(t). Para simplificar, deixamos a dependência do tempo deA velocidadedo fechamento deduzida da equação (3,5) é então

3.4

A velocidade de fechamento é constante para grandes furos e é exponencialmente pequena quando o raio R se torna minúsculo, se restringir a migração quimiotática e a proliferação. Então o raio de um grande furo começa com uma diminuição linear no tempo, mas o fechamento total levará um tempo infinito para uma realização completa. Para furos pequenos, a quimiotaxia se torna subdominante em relação à kenotaxia Ain na interface que controla a dinâmica de fechamento e o raio satisfaz uma lei difusiva em t1/2 . A Figura 3 mostra em função de R para diferentes valores de α, δ e Ain/Λ e §4 contém uma discussão de parâmetros.

3.2. Perda de circularidade

No entanto, a equação (3.4) só é válida se o contorno circular for mantido. É por isso que realizamos uma análise de estabilidade linear para feridas grandes (Ain ∼ 0) assumindo uma pequena perturbação harmónica para o raio como induzindo variações na pressão P e campo de concentração C da mesma ordem ε da seguinte forma:

3.5

onde o subscrito i indica ou uma quantidade relativa ao furo (h, 0 < r < R) ou à epiderme (e, R < r < ∞). Embora todas as quantidades perturbadoras dependam do modo n seleccionado, a análise de perturbação linear trata estes modos de forma independente. Assim, deixamos cair o índice n e calculamos os campos de concentração perturbativa ci(r) da equação (2.3)

3.6

enquanto o campo de pressão perturbado é dado por

onde levamos em conta os modos harmônicos da função holomórfica ϕ com B fixado pela lei de LaplaceDevido à fraqueza do ε, nosso sistema de equações, uma vez linearizado, pode ser resolvido analiticamente e a taxa de crescimento do modo n lê

3.7

onde

Equação (3.7) representa uma relação implícita para Ωn, resolvida por técnicas iterativas e valores positivos indicam os modos responsáveis pela desestabilização da borda circular à medida que a migração prossegue. Os resultados são apresentados para diferentes valores de Λ, α e δ, onde Ωn é apresentado na figura 4. Ver §4 para a discussão dos parâmetros. Os resultados indicam uma instabilidade que leva a um desvio de um círculo em pouco tempo, para n até um modo crítico nc (fixado pela capilaridade). É por isso que simulações numéricas são necessárias para ir além da análise linear e considerar plenamente as não linearidades.

3.3. Dinâmica completa e métodos numéricos

Discrevemos c na equação (2,2) e pressão p na equação (2,3) sobre uma malha cartesiana no espaço e implicitamente no tempo, usando um método iterativo não linear adaptativo de Gauss-Seidel . No limite do domínio, impomos tanto os valores de c como o gradiente normal de p. Em seguida o ruído é adicionado em C = c + χ com Começando com um círculo perfeito com R = 90, o fechamento da ferida é rastreado pelo método de nível definido desenvolvido em que uma função escalar Φ com descreve a ferida (Φ < 0), o epitélio (Φ > 0) e a interface (Φ = 0). O normal e a curvatura na equação (2,5) são calculados pela geometria diferencial padrão: e Φ é atualizado pela relação , onde Vext é a extensão constante de Vint na interface da equação (2,5) seguindo o gradiente Note que este método simula um fechamento circular perfeito sem ruído. De acordo com os nossos resultados, a ferida afasta-se de um círculo perfeito logo após o crescimento como mostrado nas figuras 5 e 6 e de acordo com a análise de estabilidade.

Discussão e conclusão

Existem vários parâmetros independentes neste modelo. Podemos corrigir alguns deles com os dados experimentais publicados (tabela 1). Nossa unidade de velocidade é compatível com a velocidade de fechamento da córnea (3 dias para um furo de raio de aproximadamente 3 mm) dando Λ ∼ 1 para este experimento de acordo com a equação (3.2). Na figura 4, variamos os parâmetros α e δ, que são mais difíceis de estimar, e também Λ. Devido ao grande tamanho das feridas na prática, a análise de estabilidade linear dá sempre uma instabilidade e esta conclusão é robusta às mudanças de parâmetros. Esta conclusão é confirmada por simulações totalmente não lineares sob a mesma gama de parâmetros (figuras 5 e 6). Nas simulações, o grande Λ (aproximadamente 10, tempo total aprox. 60) contribui para um fecho mais rápido em comparação com o pequeno Λ (aproximadamente 1, tempo total aprox. 600). Um exemplo típico do processo de fechamento com α = 1 e δ = 2 é mostrado na figura 5a. A interface de avanço torna-se ondulada à medida que a ferida cicatriza; contudo, quando a ferida se torna pequena, a tensão superficial reestabiliza a ferida para uma forma de batata consistente com a análise de estabilidade linear. Esta tensão superficial também pode beliscar as feridas em pedaços menores, como mostrado na figura 5b(ii), figura 6 e em . Este evento requer inicialmente um fechamento mais irregular (setas vermelhas na figura 6), quando a concentração de quimiotracto é menos homogénea dado o fluxo transversal inadequado (α = 0,1). O pinch-off pode acontecer tanto no estágio intermediário como no final do fechamento (setas amarelas), consistente com observações no estágio tardio da cicatrização de uma monocamada de células MDCK (figura 6, à direita), sugerindo o mesmo comportamento em processos mais complexos de cicatrização de feridas.

Neste trabalho, temos demonstrado teoricamente que a reepitelização da ferida dá uma instabilidade da borda sob parâmetros clinicamente realistas. Impulsionado pela quimiotaxia, o nosso modelo não introduz outras actividades celulares que fecham a ferida na fase final. No entanto, conjecturamos que esta instabilidade quimiotáxica na borda da ferida pode afectar a qualidade da reparação final. Durante a cicatrização da ferida embrionária onde é observada uma reconstrução perfeita, a ferida é fechada por um “cordão de bolsa” que representa uma coordenação de células de ponta facilitada pelo cabo de actina . Este mecanismo é perdido na pele do adulto, onde a ferida é fechada pelo rastejamento de células (várias camadas) no tecido de granulação . Em comparação com um substrato estático in vitro, o tecido de granulação sofre contração no final da reepitelização por miofibroblastos . De facto, este objectivo é juntar a borda que se assemelha ao “cordão de bolsa”, mas a contracção por estas células precisa de ser compatível com a constituição síncrona do material, o que é mecânica e sistematicamente um desafio .

No final, discutimos o nosso modelo no contexto da cicatrização da ferida cutânea in vivo. Como a ferida penetra profundamente na derme, que é o caso da maioria das feridas, as duas camadas comportam-se de forma diferente durante a reepitelização. A profundidade de uma ferida contribui para a espessura da camada inferior, onde o quimiotractor é libertado. Considerando a reepitelização onde apenas várias camadas de células se tornam móveis acima das pilhas inferiores onde o quimiotractor é libertado, a profundidade da ferida contribui matematicamente para a resistência do fluxo do quimiotractor transversal α. Além de α, que pode envolver a profundidade da ferida, são considerados a geometria, o tamanho da ferida, bem como a razão do coeficiente de difusão δ. Em comparação com experiências in vivo, o processo de cicatrização de feridas humanas pode ser diferente do dos ratos experimentais, devido às diferentes propriedades biomecânicas da pele. No entanto, se se pretende considerar o problema in vivo, tendo em conta a bioelasticidade, o desafio não vem apenas dos diferentes componentes das duas camadas, mas também do facto de a junção entre a camada dérmica e epidérmica ser altamente desordenada mesmo para a pele intacta, como demonstrado no nosso trabalho anterior. Um padrão regular deve ser definido na terceira dimensão que consideramos como “normal”. Além disso, como o tecido da ferida sofre remodelação durante a cicatrização, os parâmetros mecânicos não podem ser considerados constantes e o relaxamento do tecido evolui provavelmente numa escala temporal maior do que a reepitelização. De facto, estes processos de relaxamento também devem ser considerados na previsão da qualidade da reparação final. Antes disso, a irregularidade da borda da ferida causada pela quimiotaxia deve ser considerada como um ingrediente.

Declaração de financiamento

Este trabalho foi apoiado em parte por AAP Physique Cancer 2012.

Pés