Re-epitelizarea: avansarea frontierei epiteliului în timpul vindecării rănilor

Introducere

Pelea adultă este alcătuită din trei straturi: epiderma și derma, separate de membrana bazală. Atunci când apare o leziune profundă care distruge o parte a dermului, acesta trebuie reparat rapid pentru a restabili bariera protectoare . Vindecarea rănilor in vivo este un proces de reparare complex, orchestrat de căi intra- și intercelulare. Pentru a recupera integritatea pielii, acest proces se realizează prin patru etape succesive, dar care se suprapun: coagularea, inflamația, reepitelizarea și remodelarea. Imediat după o leziune, se formează un cheag compus în principal din fibre de fibrină și trombocite pentru a astupa rana (etapa 1). Ulterior, în următoarele 2-10 zile (etapa 2), cheagul este infiltrat continuu de celule inflamatorii care elimină resturile și eliberează factori chimici, cum ar fi factorul de creștere endotelială vasculară și factorul de creștere transformant-beta. Odată ce gradientul chimic este stabilit, diferite celule sunt recrutate pentru a fabrica noul țesut (etapa 3). Pe de o parte, neo-vasculatura și fibroblastele (care depun colagen) sunt recrutate în derm, reformând cheagul într-un țesut de granulație, care sprijină nutritiv și fizic repararea straturilor superioare. Pe de altă parte, keratinocitele migrează și proliferează la marginea plăgii pentru a extinde covorul epitelial nou format, alcătuit din mai multe straturi de celule din epidermă. Acest proces se numește reepitelizare și durează între două și trei săptămâni. La sfârșitul etapei 3, miofibroblastele transformate din fibroblaste se contractă și încearcă să adune marginea plăgii. Acestea dispar prin apoptoză în derm. Remodelarea (stadiul 4) continuă timp de luni sau chiar de ani de zile pentru a restabili homoeostazia pielii normale. Cu toate acestea, structura anatomică normală nu este cu adevărat recuperată și se formează o cicatrice din țesutul de granulație. În timp ce acest lucru este valabil în cazul rănilor mari pentru oamenii adulți, cele de la embrionii umani pot fi perfect închise, motivele nefiind pe deplin înțelese. În mod interesant, se crede că formarea cicatricilor este un sacrificiu evolutiv pentru a obține o închidere rapidă a rănilor, iar acest lucru este indicat de răspunsul inflamator intens și redundant care mediază comportamentele sistematice ale celulelor în timpul reepitelizării prin eliberarea de semnale chimice. În toate cazurile, cicatricea finală este un rezultat al interacțiunii dintre celule și micro-mediu prin intermediul factorilor fizici și chimici pe parcursul celor patru etape.

În acest caz, ne concentrăm asupra reepitelizării, când keratinocitele, celulele predominante ale epidermei, se detașează de membrana bazală, migrează spre marginea plăgii și proliferează, conduse de morfogenele din țesutul de granulație . Experimente foarte atente de migrare a epiteliului in vitro au fost efectuate recent de mai multe grupuri . Realizate pe un substrat solid, acestea implică un monostrat care avansează, motivat de comportamentul colectiv al celulelor prin migrație, generarea de forțe și reorganizarea citoscheletului celular la margine. Constatările indică o manieră neintuitivă a celulelor de a obține robustețe în timpul reparației, în care chemotaxia pare să nu fie decisivă pentru migrația celulară globală in vitro. Cu toate acestea, datorită semnalelor morfogene abundente eliberate în rană in vivo, în comparație cu experimentele in vitro, chimiotaxia domină comportamentul colectiv al celulelor în timpul procesului de vindecare a rănilor. Mai aproape de vindecarea rănilor in vivo [figura 1a(i)(ii)], a fost reconstituită o cornee artificială [figura 1b(i)(ii)] prin introducerea de celule epiteliale, fibroblaste și factori de creștere într-o placă Petri tridimensională. Este interesant faptul că toate aceste lucrări se referă la geometria circulară, mai degrabă decât la tăietura liniară realizată în experimentele anterioare . Deși bine controlate, nu este clar că aceste sisteme prezintă întreaga complexitate a vindecării rănilor in vivo . Cu toate acestea, atât experimentele in vivo, cât și cele in vitro prezintă o evoluție dezordonată a frontierelor, ceea ce indică o posibilă neregularitate universală datorată chemotaxei (figura 1).

În această lucrare, descriem reepitelizarea prin considerarea unei găuri circulare într-un țesut, adaptând un model dinamic recent de migrație chemotactică determinată de gradienți morfogenetici. Fiind continuu, modelul descrie țesutul la o scară mai mare decât dimensiunea celulelor, dar mai mică decât dimensiunea găurii. Aici, nu distingem speciile de celule sau categoriile de chemoattractanți. Acesta din urmă este furnizat în mod continuu de un flux de intrare din a treia dimensiune normală la stratul epitelial și preluat de receptorii celulare. După cum se arată în , subțirimea stratului în mișcare transformă procesul tridimensional într-un model bidimensional, în care variația localizată a grosimii la graniță contribuie la o tensiune T. În plus, presupunem că există o fricțiune vâscoasă puternică între stratul în mișcare și substrat , ceea ce permite scrierea unei legi a lui Darcy pentru câmpul vitezei medii în interiorul țesutului, în timp ce interacțiunile celulă-celulă și mitoza sunt transformate în condiții limită de interfață în limita interfeței ascuțite. Mai întâi prezentăm modelul fizic, apoi tratamentul analitic care oferă o soluție explicită pentru geometria circulară și un studiu al stabilității acesteia. Într-adevăr, în cazul unei frontiere liniare, s-a demonstrat că o instabilitate de lungime de undă lungă apare la viteze mici datorită unui mod Goldstone (invarianță translațională) pe care tensiunea superficială singură nu poate reuși să o interzică . În mod intuitiv, ne putem aștepta ca aceasta să dispară în cazul găurilor mici, deoarece efectul tensiunii superficiale se accentuează. Dimpotrivă, ca și în cazul experimentelor in vitro, găurile mai mari pot prezenta instabilități de contur care conduc la comportamente dinamice pe care urmărim să le prezicem. Pentru a merge dincolo de analiza stabilității, problema de frontieră liberă dependentă de timp necesită metode numerice capabile să rezolve ecuațiile pe domenii în evoluție. Am ales să abordăm problema noastră prin metode de tip level-set, dezvoltate pentru prima dată în anii 1980 de Osher & Sethian , care sunt capabile să urmărească automat interfețele în mișcare și schimbările topologice și au fost aplicate cu succes la probleme, cum ar fi interacțiunile lichid-gaz , procesarea imaginilor și creșterea tumorilor . Datorită naturii problemei noastre teoretice, selectăm metodologia dezvoltată pentru creșterea tumorilor . În cele ce urmează, prezentăm mai întâi modelul, introducând cei mai relevanți parametri fizici, apoi analiza pentru instabilitatea de amplitudine slabă și, în final, metode numerice și simulări pentru starea finală a închiderii.

Modelul

Considerăm o gaură circulară Ω într-o populație celulară bidimensională de densitate ρ imersată într-un mediu morfogenetic (figura 2). Celulele migrează în sus pe gradientul morfogenic, fluxul chemotactic fiind proporțional cu gradientul de concentrație al morfogenilor , cu Λc fiind o constantă de mobilitate. Repartiția morfogenilor în interiorul și în exteriorul orificiului Ω este alimentată prin surse care vin de jos. Mitoza are loc doar la graniță, iar închiderea se realizează în cea mai mare parte prin migrație. Bilanțul de masă pentru populația celulară este atunci

2,1

Nu se ia în considerare creșterea volumetrică (γ = 0) în țesut, cu excepția periferiei, densitatea celulară este constantă și ρ = ρ0. Ecuația (2.1) se simplifică la și rezultă că viteza normală a frontului este direct proporțională cu gradientul normal de concentrație. La viteze extrem de mici, migrația celulară satisface o lege a lui Darcy , Mp fiind un coeficient de porozitate egal cu pătratul înălțimii epiteliului împărțit la un coeficient de frecare. După cum se arată în , această lege se deduce în țesuturi atunci când frecarea între faze sau frecarea cu un substrat echilibrează partea hidrostatică a tensiunii elastice care acționează asupra celulelor . Rana perturbă starea homoeostatică a mediului înconjurător și o sursă de morfogene va încerca să restabilească o valoare optimă de echilibru în deschiderea c0. Luând această concentrație ca unitate pentru concentrația morfogenului (dând ), τc timpul de absorbție ca unități de timp, Le ca unitate de lungime (cu , De fiind coeficientul de difuzie în interiorul epiteliului), obținem

2,2

cu indicele h sau e referindu-se la domeniul interior (orificiu) sau exterior (epiteliu). δ = Dh/De reprezintă raportul dintre coeficientul de difuzie în gaură Dh și țesutul De, este mai mare decât 1, iar α dă puterea fluxului transversal care menține nivelul morfogenului în interiorul găurii. Din cauza încetinelii relative a migrării celulelor, neglijăm dependența de timp în ecuația (2.2). Luând De/Mp ca unitate de presiune, legea lui Darcy se simplifică în, unde, pentru simplificare, păstrăm aceeași notație pentru p și v. Din ecuația bilanțului de masă (2.1), obținem următoarea ecuație Laplace care cuplează presiunea necunoscută p cu concentrația chemoattractantului c:

2.3

Astfel, obținem, unde ϕ este o funcție holomorfă care satisface Δϕ = 0. În cele din urmă, trebuie să acordăm o atenție deosebită condițiilor la limită ale interfeței. Pentru ecuația (2.2), acestea privesc continuitatea concentrației și discontinuitatea fluxului datorată consumului de morfogen prin mitoză la graniță(pentru demonstrație, vezi ):

2.4

unde N este normala exterioară. Γ2 este rata de absorbție constrânsă la graniță discutată mai jos împreună cu ratele de mitoză Γ1 șila graniță. Capilaritatea fixează saltul de presiune la interfață

2,5

care dă condiția de frontieră liberă având în vedere efectul geometric undeeste raza de curbură locală.este egală cu raza în cazul în care geometria este un cerc. Cu toate acestea, se ia în considerare efectul local la o scară de lungime mică atunci când limita este perturbată. În același timp, vitezaa interfeței diferă de cea a epiteliului v prin proliferarea celulară la graniță și obținem

2.6

unde Γ1 este rata mitozei și σ numărul de capilare raportat la tensiunea T la interfață, astfel încâtVindecarea rănilor in vivo este dominată de migrația bidimensională, iar morfogenele nu sunt probabil nutrienții, astfel încât Γ2 dispare și Γ1c trebuie înlocuit cudacă luăm în considerare și mitoza fără efectul cantitativ al concentrațiilor de nutrienți. Numărul de capilare σ poate implica activitățile cablului de actină (microfilamente grupate) din celule. În timpul vindecării rănilor embrionare, celulele de la marginea anterioară își pot coordona cablurile de actină la nivel global, ceea ce generează un efect la nivel macroscopic. Cu toate acestea, acest comportament coordonat se pierde la adulți, astfel încât efectul cablurilor de actină poate acționa doar la nivel local. Acest lucru se aseamănă cu σ din modelul nostru, care nu este eficient în cazul rănilor mari. Luarea în considerare a setului de ecuații (2.2) și (2.3) împreună cu setul de condiții la limită (2.4), (2.5) și (2.6) arată că migrația determinată de chimioterapie este într-adevăr o problemă cu limite libere care implică mai mulți parametri pentru a reprezenta complexitatea biologică, iar studiul unor cazuri simple, de exemplu închiderea circulară, poate ajuta la înțelegerea rolurilor lor corespunzătoare. Astfel, prezentăm mai întâi rezultatele analitice pentru o gaură care rămâne circulară în permanență, apoi stabilitatea acesteia.

Rezultatele

3.1. Închiderea circulară regulată

În aproximația cvasi-statică, ecuația (2.2) poate fi rezolvată analitic și dă

3.1

I0 (resp. K0) fiind funcția Bessel modificată de ordin zero, regulată la r = 0 (resp. r → ∞). Ecuația (3.1) ia în considerare continuitatea la interfață, A fiind dată de continuitatea fluxului și se citește

3.2

cu următoarea definiție pentru(raportul a două funcții Bessel succesive) și echivalentul pentruPresiunea P0 în interiorul epiteliului devine

3,3

Utilizăm legea Laplace pentru a fixa gradul de libertate necunoscut. Funcția holomorfă ϕ, proporțională cu log(r), reprezintă o posibilă forță motrice care apare la interfață (adică așa-numita kenotaxie definită în ). Într-adevăr, chiar și în absența morfogenilor, se observă in vitro migrarea epiteliului pe substrat solid, probabil datorită reorganizării citoscheletului celular la marginea plăgii. Rețineți că modelul rămâne valabil dacă eliminăm chemotaxia, cu condiția ca definiția unităților de lungime și de timp să fie modificată. În plus, C0 și P0 depind de timp prin R(t). Pentru simplitate, renunțăm la dependența de timp aVitezade închidere dedusă din ecuația (3.5) este atunci

3.4

Viteza de închidere este constantă pentru găuri mari și este exponențial de mică atunci când raza R devine mică, dacă ne limităm la migrația și proliferarea chemotatică. Așadar, raza unei găuri mari începe cu o scădere liniară în timp, dar închiderea totală va dura un timp infinit pentru o realizare completă. Pentru găurile mici, chemotaxia devine subdominantă în comparație cu kenotaxia Ain la interfața care controlează dinamica de închidere și raza satisface o lege difuză în t1/2 . Figura 3 arată în funcție de R pentru diferite valori ale lui α, δ și Ain/Λ, iar §4 conține o discuție a parametrilor.

3.2. Pierderea circularității

Cu toate acestea, ecuația (3.4) este valabilă numai dacă se păstrează conturul circular. Este motivul pentru care efectuăm o analiză de stabilitate liniară pentru răni mari (Ain ∼ 0) presupunând o mică perturbație armonică pentru raza ca care induce variații asupra presiunii P și câmpului de concentrație C de același ordin ε, după cum urmează:

3.5

unde indicele i indică fie o mărime în raport cu gaura (h, 0 < r < R), fie cu epiderma (e, R < r < ∞). Deși toate cantitățile perturbative depind de modul n selectat, analiza perturbațiilor liniare tratează aceste moduri în mod independent. Astfel, renunțăm la indicele n și calculăm câmpurile perturbative de concentrare ci(r) din ecuația (2.3)

3.6

în timp ce câmpul de presiune perturbat este dat deunde luăm în considerare modurile armonice ale funcției holomorfe ϕ cu B fixat prin legea LaplaceDatorită slăbiciunii lui ε, sistemul nostru de ecuații, odată liniarizat, poate fi rezolvat analitic și rata de creștere a modului n se citește

3.7

unde

Ecuația (3.7) reprezintă o relație implicită pentru Ωn, rezolvată prin tehnici iterative, iar valorile pozitive indică modurile responsabile de destabilizarea frontierei circulare pe măsură ce migrația avansează. Rezultatele sunt prezentate pentru diferite valori ale lui Λ, α și δ, unde Ωn este afișat în figura 4. A se vedea §4 pentru discutarea parametrilor. Rezultatele indică o instabilitate care conduce la o deviere de la un cerc în timp scurt, pentru n până la un mod critic nc (fixat de capilaritate). Acesta este motivul pentru care simulările numerice sunt necesare pentru a depăși analiza liniară și a lua în considerare pe deplin neliniaritățile.

3.3. Dinamica completă și metode numerice

Discretizăm c din ecuația (2.2) și presiunea p din ecuația (2.3) pe o plasă carteziană în spațiu și implicit în timp, folosind o metodă iterativă neliniară adaptivă Gauss-Seidel . La limita domeniului, impunem atât valorile de dispariție ale lui c, cât și gradientul normal al lui p. Apoi, zgomotul este adăugat pe C = c + χ cu Pornind de la un cerc perfect cu R = 90, închiderea plăgii este urmărită prin metoda level-set dezvoltată în unde o funcție scalară Φ cu descrie rana (Φ < 0), epiteliul (Φ > 0) și interfața (Φ = 0). Normala și curbura din ecuația (2.5) sunt calculate prin geometrie diferențială standard: și Φ este actualizat prin relația , unde Vext este extensia constantă a lui Vint pe interfața din ecuația (2.5) urmând gradientul De remarcat că această metodă simulează o închidere circulară perfectă fără zgomot. Conform rezultatelor noastre, rana se abate de la un cerc perfect la scurt timp după creștere, așa cum se arată în figurile 5 și 6 și în concordanță cu analiza de stabilitate.

Discuție și concluzie

Există mai mulți parametri independenți în acest model. Pe unii dintre ei îi putem fixa cu datele experimentale publicate (tabelul 1). Unitatea noastră de viteză este compatibilă cu viteza de închidere a corneei (3 zile pentru o gaură cu raza de aproximativ 3 mm ), ceea ce dă Λ ∼ 1 pentru acest experiment conform ecuației (3.2). În figura 4, variem parametrii α și δ, care sunt mai dificil de estimat, precum și Λ. Din cauza dimensiunii mari a rănilor în practică, analiza stabilității liniare dă întotdeauna o instabilitate și această concluzie este robustă la modificările parametrilor. Această constatare este confirmată de simulările complet neliniare în același interval de parametri (figurile 5 și 6). În cadrul simulărilor, Λ mare (aproximativ 10, timp total aproximativ 60) contribuie la o închidere mai rapidă în comparație cu Λ mic (aproximativ 1, timp total aproximativ 600). Un exemplu tipic al procesului de închidere cu α = 1 și δ = 2 este prezentat în figura 5a. Interfața de avansare devine ondulată pe măsură ce rana se vindecă; cu toate acestea, atunci când rana devine mică, tensiunea superficială re-stabilizează rana la o formă de cartof în concordanță cu analiza stabilității liniare. Această tensiune superficială poate, de asemenea, să ciupească rănile în bucăți mai mici, așa cum se arată în figura 5b(ii), figura 6 și în . Acest eveniment necesită la început o închidere mai neregulată (săgeți roșii în figura 6), când concentrația de chemoattractant este mai puțin omogenă, dat fiind fluxul transversal inadecvat (α = 0,1). Pinch-off-ul poate avea loc atât în etapa intermediară, cât și în etapa finală a închiderii (săgeți galbene), în concordanță cu observațiile din etapa târzie a vindecării rănilor pe un monostrat de celule MDCK (figura 6, dreapta), ceea ce sugerează același comportament în procesele mai complexe de vindecare a rănilor.

În această lucrare, am demonstrat teoretic că reepitelizarea plăgii dă o instabilitate a frontierei în condiții de parametrii realiste din punct de vedere clinic. Condus de chemotaxie, modelul nostru nu introduce alte activități celulare care închid rana în stadiul final. Cu toate acestea, conjecturăm că această instabilitate chemotactică la marginea plăgii poate afecta calitatea reparației finale. În timpul vindecării rănilor embrionare, unde se observă o reconstrucție perfectă, rana este închisă de un „șnur de pungă” care reprezintă o coordonare a celulelor de la marginea frontală facilitată de cablul de actină . Acest mecanism se pierde la pielea adultă, unde rana se închide prin târârea celulelor (mai multe straturi) pe țesutul de granulație . Comparativ cu un substrat static in vitro, țesutul de granulație suferă o contracție la sfârșitul reepitelizării de către miofibroblaste . Într-adevăr, acest scop este de a aduce laolaltă marginea care se aseamănă cu „cordonul de pungă”, dar contracția acestor celule trebuie să fie compatibilă cu constituirea sincronă a materialului, ceea ce reprezintă o provocare din punct de vedere mecanic și sistematic .

În final, discutăm modelul nostru în contextul vindecării rănilor cutanate in vivo. Pe măsură ce rana pătrunde adânc în derm, ceea ce este cazul pentru majoritatea rănilor, cele două straturi se comportă diferit în timpul reepitelizării. Adâncimea unei răni contribuie la grosimea în stratul inferior în care este eliberat chemoattractantul. Având în vedere reepitelizarea în care doar câteva straturi de celule devin mobile deasupra straturilor inferioare în care este eliberat chimioattractantul, adâncimea plăgii contribuie matematic la intensitatea fluxului de chimioattractant transversal α. Pe lângă α, care poate implica adâncimea plăgii, se iau în considerare geometria, dimensiunea plăgii, precum și raportul coeficientului de difuzie δ. Comparând cu experimentele in vivo, procesul de vindecare a rănilor la om poate fi diferit de cel de la șoarecii experimentali din cauza proprietăților biomecanice diferite ale pielii. Cu toate acestea, dacă se intenționează să se ia în considerare problema in vivo ținând cont de bioelasticitate, provocarea nu provine doar din componentele diferite ale celor două straturi, ci și din faptul că joncțiunea dintre stratul dermic și cel epidermic este foarte dezordonată chiar și în cazul pielii intacte , după cum s-a arătat în lucrările noastre anterioare. Ar trebui definit un model regulat în a treia dimensiune, pe care noi îl considerăm „normal”. De asemenea, deoarece țesutul plăgii suferă remodelare în timpul vindecării, parametrii mecanici nu pot fi considerați ca fiind constanți, iar relaxarea țesutului evoluează probabil pe o scară de timp mai mare decât reepitelizarea. Într-adevăr, aceste procese de relaxare ar trebui să fie, de asemenea, luate în considerare pentru a prezice calitatea reparației finale. Înainte de aceasta, neregularitatea marginii plăgii determinată de chemotaxie ar trebui să fie considerată un ingredient.

Declarație de finanțare

Această lucrare a fost susținută parțial de AAP Physique Cancer 2012.

Notele de subsol

.