Fluorescens är ett av de viktigaste och mest användbara verktygen i en biologs verktygslåda. Inom biologin använder nästan alla områden, från fysiologi till immunologi, fluorescerande molekyler (även kallade fluorophorer) för att upptäcka proteiner. Den specifika vetenskapen bakom hur fluorescens fungerar kan dock vara förvirrande eller förbisedd.
Var inte rädd! I den här artikeln bryter vi ner de viktigaste punkterna om fluorescens så att du kan bli den expert du alltid velat vara.
Vad exakt är fluorescens?
Enligt definitionen är fluorescens en typ av fotoluminescens, vilket är vad som händer när en molekyl exciteras av ultravioletta eller synliga ljusfotoner. Mer specifikt är fluorescens resultatet av att en molekyl absorberar ljus med en viss våglängd och avger ljus med en längre våglängd.
Detaljer, tack
Tacksamt nog är det detta ämne som dr Aleksander Jablonski ägnade sitt liv åt. Han utvecklade så småningom Jablonski-diagrammet för att beskriva absorption och emission av ljus. I korthet är fluorescensens tre steg absorption (eller excitation), icke-radiativ övergång (eller exciterat tillståndets livslängd) och fluorescensemission.1
Figur 1. Jablonski-diagram. S0 och S1 representerar olika elektroniska tillstånd. De övriga siffrorna (här 0-3) representerar vibrationstillstånd. Med vänlighet av Jacobkhed.
Steg 1: Excitation
Flashback till allmän kemi: Synligt ljus existerar som elementarpartiklar som kallas fotoner. Dessa partiklar är viktiga energipaket som när de absorberas driver eller ”exciterar” den ljusabsorberande molekylen till en högre energinivå. När det gäller fluorescens absorberar fluoroforer synligt ljus, vanligtvis från en glödlampa eller laser, vilket leder till ett exciterat elektroniskt singuletttillstånd (S1) hos molekylen.
Steg 2: Livstid i exciterat tillstånd
Som vi alla vet är målet för en atom att befinna sig i ett så lågenergitillstånd som möjligt. Så när en fluorofor exciteras till ett högre elektroniskt tillstånd vill den omedelbart börja frigöra energi; därför varar detta exciterade tillstånd, känt som exciterade tillståndets livslängd, inte särskilt länge (vanligtvis 1-10 nanosekunder). Trots detta är detta steg i processen otroligt viktigt, eftersom det är under denna tid som energin från S1 börjar avklinga mot ett ”avslappnat” singulett exciterat tillstånd från vilket fluorescensutsläpp härstammar.
Steg 3: Emission
Och äntligen är vi redo för lite fluorescens! Från det ”avslappnade” exciterade tillståndet sönderfaller fotonen med hög energi snabbt mot grundtillståndet och avger denna överskottsenergi som en ljusfoton. Denna energiövergång är vad vi känner till som fluorescens. Intressant nog är energin hos den nu fluorescerande fotonen lägre än energin hos excitationsfotonen, eftersom en del av energin redan frigjordes under det exciterade tillståndets livstid. Den energi som frigörs under fluorescens kommer därför alltid att ha en längre våglängd än den som behövs för excitationen.
Hur drar flödescytometri nytta av fluorescerande molekyler?
Vi har behandlat konceptet och grunderna för flödescytometri i tidigare artiklar och i ett webbseminarium, så gå tillbaka och fräscha upp ämnet om du behöver det.
Är du redo? Då kör vi!
När vi har att göra med fluorescerande molekyler måste vi vara särskilt uppmärksamma på skillnaden mellan excitations- och emissionsvåglängderna eller energin, även känd som Stokes-skiftet. Betydelsen av Stokes-skiftet ligger i dess enkelhet: det gör det möjligt för oss att avgöra om våglängden för det emitterade ljuset och våglängden för excitationsljuset är tillräckligt stora för att vi på ett tillförlitligt sätt ska kunna skilja dem åt. Eftersom avläsningen av flödescytometri enbart baseras på fluorescens är det viktigt att vara medveten om denna parameter, annars riskerar man att generera otillförlitliga, bajsemoji-data.
Det är dessutom ytterst viktigt att hålla reda på absorptionsspektrumet och emissionsspektrumet för varje fluorofor, och hur olika lasrar kan interagera med fluoroforen i fråga. I en flödescytometriapparat avger t.ex. argonjonlasern 488 nm ljus, vilket exciterar fluoroforen fluoresceinisotiocyanat (FITC). Eftersom 488 nm ligger mycket nära FITC:s absorptionsmaximum resulterar exciteringen i hög FITC-emission. Men om FITC exciteras av en annan våglängd från en annan laser inom dess absorptionsspektrum, avges ljus i samma spektrum, men inte med samma intensitet.
Och där har du det: en snabb introduktion/påminnelse om fluorescens och hur det relaterar till fluorescerande molekyler som används i flödescytometri. Frågor? Kommentarer? Låt oss veta!