Fluoresenssi on yksi tärkeimmistä ja hyödyllisimmistä työkaluista biologin työkalupakissa. Biologiassa lähes kaikki alat fysiologiasta immunologiaan käyttävät fluoresoivia molekyylejä (eli fluoroforeja) proteiinien havaitsemiseen. Fluoresenssin toiminnan taustalla oleva erityinen tiede voi kuitenkin olla hämmentävää tai sitä ei huomioida.
Ei hätää! Tässä artikkelissa selvitämme fluoresenssin keskeiset seikat, jotta sinusta voi tulla asiantuntija, joka olet aina halunnut olla.
Mitä fluoresenssi tarkalleen ottaen ON?
Määritelmän mukaan fluoresenssi on eräänlaista fotoluminesenssia eli sitä, mitä tapahtuu, kun ultravioletti- tai näkyvän valon fotonit herättävät molekyylin. Tarkemmin sanottuna fluoresenssi on seurausta siitä, että molekyyli absorboi valoa tietyllä aallonpituudella ja emittoi valoa pidemmällä aallonpituudella.
Tietoa, kiitos
Onneksi juuri tälle aiheelle tohtori Aleksander Jablonski omisti elämänsä. Hän kehitti lopulta Jablonski-diagrammin kuvaamaan valon absorptiota ja emissiota. Lyhyesti sanottuna fluoresenssin kolme vaihetta ovat absorptio (tai heräte), ei-säteilevä siirtymä (tai herätetyn tilan elinikä) ja fluoresenssiemissio.1
Kuva 1. Jablonski-diagrammi. S0 ja S1 edustavat eri elektronitiloja. Muut numerot (tässä 0-3) edustavat värähtelytiloja. Courtesy of Jacobkhed.
Vaihe 1: heräte
Palautus yleiseen kemiaan: Näkyvä valo on olemassa alkeishiukkasina, joita kutsutaan fotoneiksi. Nämä hiukkaset ovat välttämättömiä energiapaketteja, jotka imeytyessään liikuttavat tai ”herättävät” valoa absorboivan molekyylin korkeammalle energiatasolle. Fluoresenssin tapauksessa fluoroforit absorboivat näkyvää valoa, jota yleensä saadaan hehkulampusta tai laserista, mikä johtaa molekyylin kiihdytettyyn elektroniseen singlettitilaan (S1).
Vaihe 2: kiihdytetyn tilan elinaika
Kuten kaikki tiedämme, atomin tavoitteena on olla mahdollisimman alhaisessa energiatilassa. Kun fluorofori siis kiihdytetään korkeampaan elektroniseen tilaan, se haluaa välittömästi alkaa vapauttaa energiaa; siksi tämä kiihdytetty tila, jota kutsutaan kiihdytetyn tilan elinajaksi, ei kestä kovin kauan (tyypillisesti 1-10 nanosekuntia). Siitä huolimatta tämä vaihe prosessissa on uskomattoman tärkeä, sillä tänä aikana S1:n energia alkaa hajota kohti ”rentoa” singlettiherätystilaa, josta fluoresenssiemissio saa alkunsa.
Vaihe 3: Emissio
Ja vihdoin olemme valmiita fluoresenssiin! ”Rentoutuneesta” kiihottuneesta tilasta alkaen korkeaenerginen fotoni hajoaa nopeasti kohti perustilaa ja emittoi tämän ylimääräisen energian valofotonina. Tämä energian siirtyminen tunnetaan fluoresenssina. Mielenkiintoista on, että koska osa energiasta vapautui jo virittyneen tilan elinaikana, fluoresoivan fotonin energia on pienempi kuin virittyneen fotonin energia. Näin ollen fluoresenssin aikana vapautuvan energian aallonpituus on aina pidempi kuin se, joka tarvitaan herätykseen.
Miten virtaussytometria hyödyntää fluoresoivia molekyylejä?
Käsittelimme virtaussytometrian käsitettä ja perusteita aiemmissa artikkeleissa ja webinaarissa, joten palaa takaisin ja virkistäydy aiheesta tarvittaessa.
Valmiina? Mennään!
Käsitellessämme fluoresoivia molekyylejä meidän on kiinnitettävä erityistä huomiota heräte- ja emissioaallonpituuksien tai -energian väliseen eroon, joka tunnetaan myös Stokesin siirtymänä. Stokesin siirtymän merkitys piilee sen yksinkertaisuudessa: sen avulla voimme määrittää, ovatko emittoituneen valon aallonpituus ja herätevalon aallonpituus riittävän suuret, jotta voimme luotettavasti erottaa ne toisistaan. Koska virtaussytometrian lukema perustuu yksinomaan fluoresenssiin, on olennaisen tärkeää olla tietoinen tästä parametrista, tai vaarana on tuottaa epäluotettavaa, kakka-emoji-dataa.
Lisäksi on äärimmäisen tärkeää seurata kunkin fluorofoorin absorptiospektriä ja emissiospektriä sekä sitä, miten eri laserit voivat olla vuorovaikutuksessa kyseisen fluorofoorin kanssa. Esimerkiksi virtaussytometriakoneessa argonionilaser emittoi 488 nm:n valoa, joka herättää fluorofoorin, fluoresiini-isotiosyanaatin (FITC). Koska 488 nm on hyvin lähellä FITC:n absorptiomaksimia, heräte johtaa voimakkaaseen FITC-emissioon. Jos FITC:tä kuitenkin herätetään toisella aallonpituudella eri laserilla sen absorptiospektrissä, se emittoi valoa samassa spektrissä, mutta sen voimakkuus ei ole sama.
Ja siinä se on: nopea johdanto/muistutus fluoresenssista ja siitä, miten se liittyy virtaussytometriassa käytettäviin fluoresoiviin molekyyleihin. Kysymyksiä? Kommentteja? Kerro meille!