Réépithélialisation : faire progresser la frontière de l’épithélium pendant la cicatrisation des plaies

Introduction

La peau des adultes est constituée de trois couches : l’épiderme et le derme séparés par la membrane basale. Lorsqu’une blessure profonde survient et détruit une partie du derme, celui-ci doit être réparé rapidement pour restaurer la barrière protectrice . La cicatrisation in vivo est un processus de réparation complexe orchestré par des voies intra- et intercellulaires. Pour retrouver l’intégrité de la peau, ce processus se déroule en quatre étapes successives mais qui se chevauchent : la coagulation, l’inflammation, la réépithélialisation et le remodelage. Immédiatement après une blessure, un caillot composé principalement de fibres de fibrine et de plaquettes se forme pour boucher la plaie (stade 1). Ensuite, au cours des 2 à 10 jours suivants (stade 2), le caillot est continuellement infiltré par des cellules inflammatoires qui éliminent les débris et libèrent des facteurs chimiques, tels que le facteur de croissance endothélial vasculaire et le facteur de croissance transformant bêta. Une fois le gradient chimique établi, différentes cellules sont recrutées pour fabriquer le nouveau tissu (étape 3). D’une part, la néo-vasculature et les fibroblastes (déposant du collagène) sont recrutés dans le derme, reformant le caillot en un tissu de granulation, qui soutient nutritivement et physiquement la réparation des couches supérieures. D’autre part, les kératinocytes migrent et prolifèrent au bord de la plaie pour étendre le tapis épithélial nouvellement formé, constitué de plusieurs couches de cellules dans l’épiderme. Ce processus est appelé réépithélialisation et dure deux à trois semaines. À la fin du stade 3, les myofibroblastes transformés à partir des fibroblastes se contractent et tentent de rapprocher les bords de la plaie. Ils disparaissent par apoptose dans le derme. Le remodelage (stade 4) se poursuit pendant des mois, voire des années, afin de rétablir l’homéostasie de la peau normale. Cependant, la structure anatomique normale n’est pas vraiment retrouvée et une cicatrice se forme à partir du tissu de granulation. Alors que cela est vrai pour les grandes plaies de l’homme adulte, celles de l’embryon humain peuvent être parfaitement fermées, les raisons n’étant pas entièrement comprises. Il est intéressant de noter que la formation d’une cicatrice est considérée comme un sacrifice évolutif pour obtenir une fermeture rapide de la plaie, comme l’indique la réponse inflammatoire intense et redondante qui régit les comportements cellulaires systématiques pendant la réépithélialisation en libérant des signaux chimiques. Dans tous les cas, la cicatrice finale est le résultat de l’interaction entre les cellules et le micro-environnement par le biais de facteurs physiques et chimiques au cours des quatre étapes.

Nous nous concentrons ici sur la réépithélialisation lorsque les kératinocytes, les cellules prédominantes de l’épiderme, se détachent de la membrane basale, migrent vers le bord de la plaie et prolifèrent, poussés par les morphogènes du tissu de granulation . Des expériences très minutieuses de migration d’épithélium in vitro ont été réalisées récemment par plusieurs groupes . Réalisées sur un substrat solide, elles impliquent l’avancement d’une monocouche motivée par le comportement collectif des cellules par la migration, la génération de forces et la réorganisation du cytosquelette cellulaire à la marge. Les résultats indiquent une manière non intuitive pour les cellules d’atteindre la robustesse pendant la réparation où la chimiotaxie ne semble pas être décisive pour la migration globale des cellules in vitro. Néanmoins, en raison de l’abondance des signaux morphogéniques libérés dans la plaie in vivo par rapport aux expériences in vitro, la chimiotaxie domine le comportement collectif des cellules pendant le processus de cicatrisation. Plus proche de la cicatrisation in vivo (figure 1a(i)(ii)), une cornée artificielle a été reconstituée (figure 1b(i)(ii)) par l’introduction de cellules épithéliales, de fibroblastes et de facteurs de croissance dans une boîte de Petri tridimensionnelle. Il est intéressant de noter que tous ces travaux concernent la géométrie circulaire plutôt que la coupe linéaire réalisée dans les expériences précédentes . Bien que bien contrôlés, il n’est pas certain que ces systèmes présentent toute la complexité de la cicatrisation in vivo . Néanmoins, les expériences in vivo et in vitro présentent toutes deux une évolution désordonnée des frontières, ce qui indique une possible irrégularité universelle due à la chimiotaxie (figure 1).

Dans ce travail, nous décrivons la réépithélialisation en considérant un trou circulaire dans un tissu, en adaptant un modèle dynamique récent de migration chimiotactique conduite par des gradients morphogénétiques. Étant continu, le modèle décrit le tissu à une échelle plus grande que la taille des cellules mais plus petite que la taille du trou. Ici, nous ne distinguons pas les espèces cellulaires ni les catégories de chimioattracteurs. Ce dernier est continuellement alimenté par un flux entrant provenant de la troisième dimension normale à la couche épithéliale et capté par les récepteurs cellulaires. Comme le montre l’article , la finesse de la couche mobile transforme le processus tridimensionnel en un modèle bidimensionnel, où la variation d’épaisseur localisée à la frontière contribue à une tension T. En outre, nous supposons qu’une forte friction visqueuse existe entre la couche mobile et le substrat , ce qui permet d’écrire une loi de Darcy pour le champ de vitesse moyen à l’intérieur du tissu, tandis que les interactions cellule-cellule et la mitose sont transformées en conditions limites d’interface dans la limite d’interface nette. Nous présentons d’abord le modèle physique, puis le traitement analytique donnant une solution explicite pour la géométrie circulaire et une étude de sa stabilité. En effet, dans le cas d’une frontière linéaire, il a été montré qu’une instabilité de grande longueur d’onde se produit aux faibles vitesses en raison d’un mode de Goldstone (invariance translationnelle) que la tension de surface seule ne peut réussir à interdire . Intuitivement, on peut s’attendre à ce qu’elle disparaisse pour les petits trous car l’effet de la tension de surface s’accentue. Au contraire, comme pour les expériences in vitro, les trous plus grands peuvent présenter des instabilités de contour conduisant à des comportements dynamiques que nous cherchons à prédire. Pour aller au-delà de l’analyse de la stabilité, le problème des frontières libres dépendant du temps nécessite des méthodes numériques capables de résoudre des équations sur des domaines évolutifs. Nous avons choisi d’aborder notre problème par des méthodes de niveau, développées dans les années 1980 par Osher & Sethian, qui sont capables de suivre automatiquement les interfaces mobiles et les changements topologiques et ont été appliquées avec succès à des problèmes tels que les interactions liquide-gaz, le traitement de l’image et la croissance tumorale. En raison de la nature de notre problème théorique, nous choisissons la méthodologie développée pour la croissance tumorale. Dans ce qui suit, nous présentons d’abord le modèle, en introduisant les paramètres physiques les plus pertinents, puis l’analyse pour l’instabilité de faible amplitude, et enfin les méthodes numériques et les simulations pour l’état ultime de la fermeture.

Le modèle

Nous considérons un trou circulaire Ω dans une population cellulaire bidimensionnelle de densité ρ immergée dans un environnement morphogénétique (figure 2). Les cellules migrent vers le haut du gradient morphogène, le flux chimiotactique étant proportionnel au gradient de concentration des morphogènes , avec Λc étant une constante de mobilité. La répartition des morphogènes à l’intérieur et à l’extérieur du trou Ω est alimentée par des sources venant du bas. La mitose ne se produit qu’à la frontière et la fermeture est surtout réalisée par la migration. Le bilan de masse de la population cellulaire est alors

2,1

Négligeant la croissance volumétrique (γ = 0) dans le tissu sauf à la périphérie, la densité cellulaire est constante et ρ = ρ0. L’équation (2.1) se simplifie en et donne que la vitesse normale du front est directement proportionnelle au gradient normal de concentration. Aux vitesses extrêmement faibles, la migration cellulaire satisfait une loi de Darcy , Mp étant un coefficient de porosité égal au carré de la hauteur de l’épithélium divisé par un coefficient de friction. Comme le montre , cette loi se déduit dans les tissus lorsque la friction entre les phases ou la friction avec un substrat équilibre la partie hydrostatique de la contrainte élastique agissant sur les cellules . La blessure perturbe l’état homéostatique du milieu environnant et une source de morphogènes va tenter de rétablir une valeur d’équilibre optimale dans l’ouverture c0. En prenant cette concentration comme unité de concentration du morphogène (ce qui donne ), τc le temps d’absorption comme unités de temps, Le comme unité de longueur (avec , De étant le coefficient de diffusion à l’intérieur de l’épithélium), on obtient

2,2

avec l’indice h ou e se référant au domaine interne (trou) ou externe (épithélium). δ = Dh/De représente le rapport entre le coefficient de diffusion dans le trou Dh et le tissu De, il est supérieur à 1, et α donne la force du flux transversal qui maintient le niveau de morphogène à l’intérieur du trou. En raison de la lenteur relative de la migration cellulaire, nous négligeons la dépendance au temps dans l’équation (2.2). En prenant De/Mp comme unité de pression, on simplifie la loi de Darcy en

, où pour des raisons de simplicité nous gardons la même notation pour p et v. A partir de l’équation du bilan de masse (2.1), nous obtenons l’équation de Laplace suivante couplant la pression inconnue p à la concentration de chimioattractant c:

2.3

Donc, on obtient, où ϕ est une fonction holomorphe qui satisfait Δϕ = 0. Enfin, nous devons porter une attention particulière aux conditions aux limites de l’interface. Pour l’équation (2.2), elles concernent la continuité de la concentration et la discontinuité du flux due à la consommation du morphogène par la mitose à la frontière(pour la démonstration, voir ):

2,4

où N est la normale extérieure. Γ2 est le taux d’absorption contraint à la frontière discuté ci-dessous avec les taux de mitose Γ1 età la frontière. La capillarité fixe le saut de pression à l’interface

2,5

ce qui donne la condition de frontière libre en considérant l’effet géométrique oùest le rayon de courbure local.est égal au rayon si la géométrie est un cercle. Cependant, il considère l’effet local à petite échelle de longueur lorsque la frontière est perturbée. En même temps, la vitessede l’interface diffère de celle de l’épithélium v par la prolifération cellulaire à la frontière et on obtient

2.6

où Γ1 est le taux de mitose et σ le nombre de capillaires lié à la tension T à l’interface doncLa cicatrisation des plaies in vivo est dominée par une migration bidimensionnelle et les morphogènes ne sont probablement pas les nutriments, donc Γ2 disparaît et Γ1c doit être remplacé parsi on considère aussi la mitose sans l’effet quantitatif des concentrations en nutriments. Le nombre de capillaires σ peut impliquer les activités du câble d’actine (microfilaments en faisceau) dans les cellules. Pendant la cicatrisation des plaies embryonnaires, les cellules du bord antérieur peuvent coordonner leurs câbles d’actine de manière globale, ce qui génère un effet au niveau macroscopique. Cependant, ce comportement coordonné est perdu chez les adultes, de sorte que l’effet des câbles d’actine ne peut agir que localement. Cela ressemble à σ dans notre modèle qui n’est pas efficace pour les grandes plaies. Si l’on considère l’ensemble des équations (2.2) et (2.3) en conjonction avec l’ensemble des conditions aux limites (2.4), (2.5) et (2.6), on constate que la migration chimiotatique est en fait un problème à limites libres impliquant plusieurs paramètres pour représenter la complexité biologique et l’étude de cas simples, par exemple la fermeture circulaire, peut aider à comprendre leurs rôles correspondants. Ainsi, nous présentons d’abord les résultats analytiques pour un trou restant circulaire à tout moment, puis sa stabilité.

Les résultats

3.1. Fermeture circulaire régulière

Dans l’approximation quasi-statique, l’équation (2.2) peut être résolue analytiquement et donne

3.1

I0 (resp. K0) étant la fonction de Bessel modifiée d’ordre zéro, régulière à r = 0 (resp. r → ∞). L’équation (3.1) tient compte de la continuité à l’interface, A étant donné par la continuité du flux et se lit

3.2

avec la définition suivante pour(rapport de deux fonctions de Bessel successives) et l’équivalent pourLa pression P0 à l’intérieur de l’épithélium devient

3,3

Nous utilisons la loi de Laplace pour fixer le degré de liberté inconnu. La fonction holomorphe ϕ, proportionnelle à log(r), représente une éventuelle force motrice qui apparaît à l’interface (c’est-à-dire la soi-disant kénotaxie définie en ). En effet, même en l’absence de morphogènes, on observe in vitro la migration de l’épithélium sur un substrat solide, peut-être grâce à la réorganisation du cytosquelette cellulaire à la marge de la plaie. Notons que le modèle reste valide si on écarte la chimiotaxie à condition de modifier la définition des unités de longueur et de temps. De plus, C0 et P0 dépendent du temps via R(t). Pour simplifier, nous abandonnons la dépendance temporelle deLa vitessede la fermeture déduite de l’équation (3.5) est alors

3.4

La vitesse de fermeture est constante pour les grands trous et est exponentiellement petite lorsque le rayon R devient minuscule, si on se restreint sur la migration et la prolifération chimiotatique. Ainsi le rayon d’un grand trou commence par une diminution linéaire du temps mais la fermeture totale prendra un temps infini pour une réalisation complète. Pour les petits trous, la chimiotaxie devient sous-dominante par rapport à la kénotaxie Ain à l’interface qui contrôle la dynamique de fermeture et le rayon satisfait une loi diffusive en t1/2 . La figure 3 montre en fonction de R pour différentes valeurs de α, δ et Ain/Λ et le §4 contient une discussion des paramètres.

3.2. Perte de circularité

Cependant, l’équation (3.4) n’est valable que si le contour circulaire est maintenu. C’est pourquoi nous effectuons une analyse de stabilité linéaire pour les grandes plaies (Ain ∼ 0) en supposant une petite perturbation harmonique pour le rayon comme induisant des variations sur la pression P et le champ de concentration C du même ordre ε comme suit :

3.5

où l’indice i indique soit une quantité relative au trou (h, 0 < r < R), soit à l’épiderme (e, R < r < ∞). Bien que toutes les quantités perturbatives dépendent du mode sélectionné n, l’analyse des perturbations linéaires traite ces modes indépendamment. Nous abandonnons donc l’indice n et calculons les champs de concentration perturbatifs ci(r) à partir de l’équation (2.3)

3.6

alors que le champ de pression perturbé est donné paroù nous prenons en compte les modes harmoniques de la fonction holomorphe ϕ avec B fixé par la loi de LaplaceEn raison de la faiblesse de ε, notre système d’équations, une fois linéarisé, peut être résolu analytiquement et le taux de croissance du mode n se lit

3.7

où

L’équation (3.7) représente une relation implicite pour Ωn, résolue par des techniques itératives et les valeurs positives indiquent les modes responsables de la déstabilisation de la frontière circulaire au fur et à mesure de la migration. Les résultats sont présentés pour différentes valeurs de Λ, α et δ, où Ωn est affiché dans la figure 4. Voir §4 pour la discussion des paramètres. Les résultats indiquent une instabilité conduisant à une déviation du cercle en temps court, pour n jusqu’à un mode critique nc (fixé par la capillarité). C’est pourquoi les simulations numériques sont nécessaires pour aller au-delà de l’analyse linéaire et considérer pleinement les non-linéarités.

3.3. Dynamique complète et méthodes numériques

Nous discrétisons c dans l’équation (2.2) et la pression p dans l’équation (2.3) sur un maillage cartésien dans l’espace et implicitement dans le temps, en utilisant une méthode itérative adaptative non linéaire de Gauss-Seidel . À la frontière du domaine, nous imposons à la fois des valeurs de vanité de c et un gradient normal de p. Puis le bruit est ajouté sur C = c + χ avec En commençant par un cercle parfait avec R = 90, la fermeture de la plaie est suivie par la méthode level-set développée dans où une fonction scalaire Φ avec décrit la plaie (Φ < 0), l’épithélium (Φ > 0) et l’interface (Φ = 0). La normale et la courbure dans l’équation (2.5) sont calculées par la géométrie différentielle standard : et Φ est actualisé par la relation , où Vext est l’extension constante de Vint sur l’interface à partir de l’équation (2.5) suivant le gradient Notons que cette méthode simule une fermeture circulaire parfaite sans bruit. Selon nos résultats, la plaie s’écarte d’un cercle parfait peu après la croissance comme le montrent les figures 5 et 6 et en accord avec l’analyse de stabilité.

Discussion et conclusion

Il y a plusieurs paramètres indépendants dans ce modèle. Nous pouvons fixer certains d’entre eux avec les données expérimentales publiées (tableau 1). Notre unité de vitesse est compatible avec la vitesse de fermeture de la cornée (3 jours pour un trou de rayon d’environ 3 mm ) donnant Λ ∼ 1 pour cette expérience selon l’équation (3.2). Dans la figure 4, nous faisons varier les paramètres α et δ, qui sont plus difficiles à estimer, ainsi que Λ. En raison de la grande taille des plaies en pratique, l’analyse de stabilité linéaire donne toujours une instabilité et cette conclusion est robuste aux changements de paramètres. Cette conclusion est confirmée par des simulations entièrement non linéaires dans la même plage de paramètres (figures 5 et 6). Dans les simulations, un grand Λ (environ 10, temps total environ 60) contribue à une fermeture plus rapide par rapport à un petit Λ (environ 1, temps total environ 600). Un exemple typique du processus de fermeture avec α = 1 et δ = 2 est représenté sur la figure 5a. L’interface d’avancement devient ondulée au fur et à mesure de la guérison de la plaie ; cependant, lorsque la plaie devient petite, la tension superficielle re-stabilise la plaie en une forme de pomme de terre conforme à l’analyse de stabilité linéaire. Cette tension de surface peut également pincer les plaies pour en faire de plus petits morceaux, comme le montrent la figure 5b(ii), la figure 6 et la figure . Cet événement nécessite d’abord une fermeture plus irrégulière (flèches rouges dans la figure 6), lorsque la concentration de chimioattractant est moins homogène étant donné un flux transversal inadéquat (α = 0,1). Le pincement peut se produire à la fois au stade intermédiaire ou à la fin de la fermeture (flèches jaunes), ce qui est cohérent avec les observations au stade tardif de la cicatrisation sur une monocouche de cellules MDCK (figure 6, à droite), suggérant le même comportement dans des processus de cicatrisation plus complexes.

Dans ce travail, nous avons montré théoriquement que la réépithélialisation de la plaie donne une instabilité de la frontière sous des paramètres cliniquement réalistes. Conduit par la chimiotaxie, notre modèle n’introduit pas d’autres activités cellulaires qui ferment la plaie au stade ultime. Cependant, nous conjecturons que cette instabilité chimiotactique à la frontière de la plaie peut affecter la qualité de la réparation finale. Au cours de la cicatrisation des plaies embryonnaires, où une reconstruction parfaite est observée, la plaie est fermée par un « cordon de bourse » qui représente une coordination des cellules du bord supérieur facilitée par le câble d’actine. Ce mécanisme est perdu dans la peau adulte, où la plaie est fermée par la reptation des cellules (plusieurs couches) sur le tissu de granulation. Par rapport à un substrat statique in vitro, le tissu de granulation subit une contraction à la fin de la réépithélialisation par les myofibroblastes. En effet, ce but est de rapprocher le bord, ce qui ressemble au « cordon de bourse », mais la contraction par ces cellules doit être compatible avec la constitution synchrone du matériau, ce qui est mécaniquement et systématiquement un défi .

À la fin, nous discutons notre modèle dans le contexte de la cicatrisation de la peau in vivo. Lorsque la plaie s’enfonce profondément dans le derme, ce qui est le cas pour la plupart des plaies, les deux couches se comportent différemment lors de la réépithélialisation. La profondeur d’une plaie contribue à l’épaisseur de la couche inférieure où le chimioattractant est libéré. Si l’on considère la réépithélialisation où seules quelques couches de cellules deviennent mobiles au-dessus des couches inférieures où le chimio-attractant est libéré, la profondeur de la plaie contribue mathématiquement à l’intensité du flux transversal de chimio-attractant α. Outre α, qui peut impliquer la profondeur de la plaie, la géométrie, la taille de la plaie ainsi que le rapport du coefficient de diffusion δ sont pris en compte. Si l’on compare avec les expériences in vivo, le processus de cicatrisation des plaies humaines peut être différent de celui des souris expérimentales en raison des différentes propriétés biomécaniques de la peau. Cependant, si l’on veut considérer le problème in vivo en tenant compte de la bioélasticité, le défi ne vient pas seulement des différents composants des deux couches, mais aussi du fait que la jonction entre la couche dermique et la couche épidermique est fortement désordonnée, même pour la peau intacte, comme l’ont montré nos travaux précédents. Un modèle régulier doit être défini dans la troisième dimension que nous considérons comme « normale ». De plus, comme le tissu de la plaie subit un remodelage pendant la cicatrisation, les paramètres mécaniques ne peuvent pas être considérés comme des constantes et la relaxation du tissu évolue probablement sur une plus grande échelle de temps que la réépithélialisation. En effet, ces processus de relaxation devraient également être pris en compte pour prédire la qualité de la réparation finale. Avant cela, l’irrégularité de la bordure de la plaie conduite par la chimiotaxie devrait être considérée comme un ingrédient.

Déclaration de financement

Ce travail a été soutenu en partie par l’AAP Physique Cancer 2012.

Notes de bas de page