Fluorescentie is een van de belangrijkste en nuttigste gereedschappen in de gereedschapskist van een bioloog. In de biologie wordt op bijna elk gebied, van fysiologie tot immunologie, gebruik gemaakt van fluorescerende moleculen (ook wel fluoroforen genoemd) om eiwitten te detecteren. De specifieke wetenschap achter de werking van fluorescentie kan echter verwarrend zijn of over het hoofd worden gezien.
Heb geen angst! In dit artikel bespreken we de belangrijkste punten van fluorescentie, zodat u de expert kunt worden die u altijd al wilde zijn.
Wat IS Fluorescentie precies?
Fluorescentie is per definitie een soort fotoluminescentie, dat wil zeggen wat er gebeurt wanneer een molecuul wordt geëxciteerd door ultraviolette of zichtbare lichtfotonen. Meer specifiek is fluorescentie het resultaat van een molecuul dat licht absorbeert bij een specifieke golflengte en licht uitzendt bij een langere golflengte.
Details, alstublieft
Gelukkig heeft Dr. Aleksander Jablonski zijn leven aan dit onderwerp gewijd. Hij ontwikkelde uiteindelijk het Jablonski diagram om de absorptie en emissie van licht te beschrijven. Kort samengevat zijn de 3 stappen van fluorescentie: absorptie (of excitatie), niet-radiatieve transitie (of levensduur van de aangeslagen toestand), en fluorescentie-emissie.1
Figuur 1. Jablonski-diagram. S0 en S1 staan voor verschillende elektronische toestanden. De andere getallen (hier 0-3) staan voor de vibratietoestanden. Met dank aan Jacobkhed.
Stap 1: Excitatie
Flashback naar de Algemene Scheikunde: zichtbaar licht bestaat als elementaire deeltjes die fotonen worden genoemd. Deze deeltjes zijn essentiële energiepakketjes die, wanneer zij worden geabsorbeerd, het licht-absorberende molecuul naar een hoger energieniveau stuwen of “exciteren”. In het geval van fluorescentie absorberen fluoroforen zichtbaar licht, gewoonlijk afkomstig van een gloeilamp of laser, wat leidt tot een aangeslagen elektronische singlet toestand (S1) van het molecuul.
Stap 2: Levensduur van de opgewekte toestand
Zoals we allemaal weten, is het doel van een atoom om in de laagst mogelijke energietoestand te zijn. Dus wanneer een fluorofoor wordt geëxciteerd tot een hogere elektronische toestand, wil het onmiddellijk beginnen energie vrij te geven; daarom duurt deze geëxciteerde toestand, bekend als de excited-state lifetime, niet erg lang (typisch 1-10 nanoseconden). Toch is deze stap in het proces ongelooflijk belangrijk, omdat het in deze tijd is dat de energie van S1 begint te vervallen naar een “ontspannen” singlet aangeslagen toestand van waaruit fluorescentie-emissie ontstaat.
Stap 3: Emissie
En eindelijk zijn we klaar voor wat fluorescentie! Beginnend in de “ontspannen” aangeslagen toestand, vervalt het hoogenergetische foton snel naar de grondtoestand en zendt deze overtollige energie als een lichtfoton uit. Deze overgang van energie is wat wij kennen als fluorescentie. Interessant is dat, omdat een deel van die energie al was vrijgekomen tijdens de levensduur van de aangeslagen toestand, de energie van het nu fluorescerende foton lager is dan de energie van het excitatie foton. De energie die vrijkomt bij fluorescentie zal dus altijd van een langere golflengte zijn dan die welke nodig is voor excitatie.
Hoe haalt Flow Cytometry voordeel uit fluorescerende moleculen?
We hebben het concept en de basisprincipes van flowcytometrie in eerdere artikelen en een webinar behandeld, dus ga nog eens terug en fris het onderwerp op als dat nodig is.
Klaar?
Wanneer we te maken hebben met fluorescerende moleculen, moeten we speciale aandacht besteden aan het verschil tussen de excitatie- en emissiegolflengte of -energie, ook wel bekend als de Stokes-verschuiving. Het belang van de Stokes-verschuiving ligt in haar eenvoud: zij stelt ons in staat te bepalen of de golflengte van het uitgezonden licht en de golflengte van het excitatielicht groot genoeg zijn om ze betrouwbaar uit elkaar te houden. Aangezien de uitlezing van flowcytometrie uitsluitend op fluorescentie is gebaseerd, is het van essentieel belang van deze parameter op de hoogte te zijn, of het risico te lopen onbetrouwbare, poep-emoji gegevens te genereren.
Daarnaast is het uiterst belangrijk het absorptiespectrum en emissiespectrum voor elke fluorofoor bij te houden, en hoe verschillende lasers kunnen interageren met de fluorofoor in kwestie. In een flowcytometrie-machine zendt de argon-ion-laser bijvoorbeeld 488-nm licht uit, dat de fluorofoor fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC) exciteert. Omdat de 488-nm zeer dicht bij het absorptiemaximum van FITC ligt, resulteert excitatie in hoge FITC-emissie. Als FITC echter wordt geëxciteerd door een andere golflengte van een andere laser binnen zijn absorptiespectrum, zendt het licht uit in hetzelfde spectrum, maar niet met dezelfde intensiteit.
En daar hebt u het: een snelle inleiding/herinnering over fluorescentie en hoe die verband houdt met fluorescerende moleculen die in flowcytometrie worden gebruikt. Vragen? Opmerkingen? Laat het ons weten!