Re-epithelialization: advancing epithelium frontier during wound healing

Introduction

De volwassen huid bestaat uit drie lagen: de opperhuid en de lederhuid, van elkaar gescheiden door het basaalmembraan. Wanneer een diepe verwonding optreedt die een deel van de dermis vernietigt, moet deze snel worden hersteld om de beschermende barrière te herstellen. In vivo wondgenezing is een complex herstelproces dat georkestreerd wordt door intra- en intercellulaire paden. Om de integriteit van de huid te herstellen, verloopt dit proces in vier opeenvolgende maar overlappende fasen: stolling, ontsteking, re-epithelialisatie en remodellering. Onmiddellijk na een verwonding wordt een stolsel gevormd dat hoofdzakelijk bestaat uit fibrinevezels en bloedplaatjes om de wond af te sluiten (fase 1). Vervolgens wordt het stolsel in de volgende 2-10 dagen (stadium 2) voortdurend geïnfiltreerd door ontstekingscellen die het afval opruimen en chemische factoren vrijgeven, zoals vasculaire endotheel-groeifactor en transformerende groeifactor-beta. Zodra de chemische gradiënt tot stand is gebracht, worden verschillende cellen gerekruteerd om het nieuwe weefsel aan te maken (stadium 3). Enerzijds worden in de lederhuid neo-vasculatuur en fibroblasten (die collageen afzetten) gerekruteerd, die het stolsel omvormen tot een granulatieweefsel, dat het herstel van de bovenste lagen voedzaam en fysiek ondersteunt. Anderzijds migreren en prolifereren keratinocyten aan de rand van de wond om het nieuw gevormde epitheliale tapijt van verschillende cellagen in de epidermis uit te breiden. Dit proces wordt re-epithelialisatie genoemd en duurt twee tot drie weken. Aan het einde van stadium 3 trekken de uit fibroblasten getransformeerde myofibroblasten samen en proberen de wondrand bijeen te brengen. Zij verdwijnen door apoptose in de dermis. De remodellering (stadium 4) gaat maanden of zelfs jaren door om de homo-eostase van de normale huid te herstellen. De normale anatomische structuur wordt echter niet echt hersteld en er wordt een litteken gevormd uit het granulatieweefsel. Terwijl dit geldt voor grote wonden bij volwassen mensen, kunnen die bij menselijke embryo’s perfect worden gesloten, waarvoor de redenen niet volledig worden begrepen. Interessant is dat men aanneemt dat littekenvorming een evolutionair offer is om tot een snelle wondsluiting te komen, hetgeen blijkt uit de intense en overbodige ontstekingsreactie die het systematische celgedrag tijdens de re-epithelialisatie medieert door chemische signalen af te geven. In alle gevallen is het uiteindelijke litteken een resultaat van de wisselwerking tussen cellen en de micro-omgeving door fysische en chemische factoren tijdens de vier stadia.

Hierbij richten we ons op re-epithelialisatie wanneer keratinocyten, de overheersende epidermale cellen, zich losmaken van het basaal membraan, migreren naar de wondrand en zich vermenigvuldigen, aangedreven door morfogenen in het granulatieweefsel. Zeer zorgvuldige in vitro migratie-experimenten van epitheelcellen zijn recentelijk door verschillende groepen uitgevoerd. Ze werden uitgevoerd op een vast substraat en impliceren een oprukkende monolaag die gemotiveerd wordt door het collectieve gedrag van cellen door migratie, het opwekken van krachten en de reorganisatie van het celcytoskelet aan de rand. De bevindingen wijzen op een niet-intuïtieve manier van cellen om robuustheid te bereiken tijdens de reparatie waarbij chemotaxis niet doorslaggevend lijkt te zijn voor de globale celmigratie in vitro. Niettemin, als gevolg van de overvloedige morfogene signalen vrijgegeven in de wond in vivo in vergelijking met in vitro experimenten, chemotaxis domineert het collectieve gedrag van cellen tijdens de wond-genezing proces. Dichter bij in vivo wondgenezing (figuur 1a(i)(ii)) is een kunstmatig hoornvlies gereconstrueerd (figuur 1b(i)(ii)) door de introductie van epitheelcellen, fibroblasten en groeifactoren in een drie-dimensionale petrischaal. Interessant is dat al deze werken betrekking hebben op de cirkelvormige geometrie in plaats van de lineaire snede gedaan in eerdere experimenten . Hoewel goed gecontroleerd, is het onduidelijk of deze systemen de gehele complexiteit van in vivo wondgenezing weergeven. Niettemin vertonen zowel de in vivo als de in vitro experimenten een ongeordende evolutie van de randen, wat wijst op een mogelijke universele onregelmatigheid ten gevolge van chemotaxis (figuur 1).

In dit werk beschrijven we de re-epithelialisatie door een cirkelvormig gat in een weefsel te beschouwen, waarbij een recent dynamisch model van chemotactische migratie aangedreven door morfogenetische gradiënten wordt aangepast. Omdat het model continu is, beschrijft het het weefsel op een schaal groter dan de celgrootte maar kleiner dan de grootte van het gat. Hier maken we geen onderscheid tussen celsoorten of de categorieën chemoattractanten. Deze laatste wordt continu aangevoerd door een inkomende flux uit de derde dimensie normaal voor de epitheellaag en opgenomen door celreceptoren. Zoals aangetoond in , transformeert de dunheid van de bewegende laag het driedimensionale proces in een tweedimensionaal model, waar de gelokaliseerde diktevariatie aan de grens bijdraagt tot een spanning T. Bovendien nemen we aan dat er een sterke viskeuze wrijving bestaat tussen de bewegende laag en het substraat , wat toelaat een wet van Darcy te schrijven voor het gemiddelde snelheidsveld binnenin het weefsel, terwijl cel-cel interacties en mitose getransformeerd worden in interface randvoorwaarden in de scherpe interface limiet. Eerst wordt het fysisch model voorgesteld, daarna de analytische behandeling met een expliciete oplossing voor de cirkelvormige geometrie en een studie van de stabiliteit. In het geval van een lineaire grens is inderdaad aangetoond dat een lange golflengte instabiliteit optreedt bij lage snelheden ten gevolge van een Goldstone mode (translationele invariantie) die oppervlaktespanning alleen niet kan tegenhouden . Intuïtief zou men kunnen verwachten dat deze verdwijnt voor kleine gaten naarmate het oppervlaktespanningseffect toeneemt. Integendeel, zoals bij experimenten in vitro, kunnen grotere gaten contourinstabiliteiten vertonen die leiden tot dynamisch gedrag dat wij willen voorspellen. Om verder te gaan dan de stabiliteitsanalyse, vereist het tijdsafhankelijke vrij-grens probleem numerieke methoden die vergelijkingen kunnen oplossen op evoluerende domeinen. Wij kiezen ervoor om ons probleem aan te pakken met level-set methoden, voor het eerst ontwikkeld in de jaren 1980 door Osher & Sethian , die in staat zijn om bewegende grensvlakken en topologische veranderingen automatisch te volgen en met succes zijn toegepast op problemen, zoals vloeistof-gas interacties , beeldverwerking en tumorgroei . Gezien de aard van ons theoretisch probleem, kiezen wij voor de methodologie ontwikkeld voor tumorgroei. In het volgende stellen we eerst het model voor, waarbij we de meest relevante fysische parameters introduceren, vervolgens de analyse voor zwakke amplitude-instabiliteit, en tenslotte numerieke methoden en simulaties voor de uiteindelijke toestand van de sluiting.

Het model

We beschouwen een cirkelvormig gat Ω in een tweedimensionale celpopulatie van dichtheid ρ ondergedompeld in een morfogenetische omgeving (figuur 2). Cellen migreren langs de morfogene gradiënt omhoog, waarbij de chemotactische flux evenredig is met de concentratiegradiënt van morfogenen , waarbij Λc een mobiliteitsconstante is. De verdeling van morfogenen binnen en buiten het gat Ω wordt gevoed door bronnen die van onderaf komen. Mitose vindt alleen plaats aan de rand en de sluiting wordt grotendeels tot stand gebracht door de migratie. De massabalans voor de celpopulatie is dan

2.1

Als we geen rekening houden met volumetrische groei (γ = 0) in het weefsel behalve aan de periferie, is de celdichtheid constant en ρ = ρ0. Vergelijking (2.1) vereenvoudigt tot en geeft aan dat de normale snelheid van het front recht evenredig is met de normale concentratiegradiënt. Bij extreem lage snelheden voldoet de celmigratie aan de wet van Darcy , waarbij Mp een porositeitscoëfficiënt is die gelijk is aan het kwadraat van de hoogte van het epitheel gedeeld door een wrijvingscoëfficiënt. Zoals aangetoond in , wordt deze wet in weefsels afgeleid wanneer de wrijving tussen de fasen of de wrijving met een substraat het hydrostatische deel van de elastische spanning die op de cellen werkt in evenwicht houdt. De wond verstoort de homoeostatische toestand van de omgeving en een bron van morfogenen zal trachten een optimale evenwichtswaarde in de opening c0 te herstellen. Nemen we deze concentratie als eenheid voor de morfogene concentratie (wat oplevert), τc de opnametijd als tijdseenheden, Le als lengte-eenheid (met , De is de diffusiecoëfficiënt binnen het epitheel), dan krijgen we

2.2

waarbij de index h of e verwijst naar het binnenste (gat) of buitenste (epitheel) domein. δ = Dh/De staat voor de verhouding tussen de diffusiecoëfficiënt in het gat Dh en het weefsel De, en is groter dan 1, en α geeft de sterkte aan van de transversale flux die het morfogenenniveau in het gat handhaaft. Vanwege de relatieve traagheid van de celmigratie verwaarlozen we de tijdsafhankelijkheid in vergelijking (2.2). Door De/Mp als drukeenheid te nemen, wordt de wet van Darcy vereenvoudigd tot

, waarbij we voor de eenvoud dezelfde notatie voor p en v aanhouden. Uit massabalansvergelijking (2.1) krijgen we de volgende Laplace-vergelijking die de onbekende druk p koppelt aan de chemoattractantconcentratie c:

2.3

Zo krijgen we, waarbij ϕ een holomorfe functie is die voldoet aan Δϕ = 0. Tenslotte moeten we speciale aandacht besteden aan de grensvlakrandvoorwaarden. Voor vergelijking (2.2) betreffen zij de concentratiecontinuïteit en de fluxdiscontinuïteit ten gevolge van de morfogenenopname door mitose aan de grens(voor demonstratie, zie ):

2.4

waar N de buitennormaal is. Γ2 is de opnamesnelheid die aan de hieronder besproken grens wordt begrensd, samen met de mitosesnelheden Γ1 enaan de grens. Capillariteit fixeert de druksprong op het grensvlak

2.5

wat de vrij-grensvoorwaarde geeft rekening houdend met het geometrisch effect waarbijde lokale kromtestraal is.is gelijk aan de straal indien de geometrie een cirkel is. Het beschouwt echter het lokale effect op kleine lengteschaal wanneer de grens wordt verstoord. Tegelijkertijd verschilt de snelheidvan het grensvlak van die van het epitheel v door de celproliferatie aan de grens en krijgen we

2.6

waar Γ1 de mitosesnelheid is en σ het capillaire aantal gerelateerd aan de spanning T aan de interface zodatWondgenezing in vivo wordt gedomineerd door tweedimensionale migratie en de morfogenen waarschijnlijk niet de voedingsstoffen zijn, zodat Γ2 verdwijnt en Γ1c moet worden vervangen doorals we ook mitose beschouwen zonder het kwantitatieve effect van de voedingsstoffenconcentraties. Het capillaire aantal σ kan te maken hebben met de activiteiten van actinekabels (gebundelde microfilamenten) in de cellen. Tijdens de embryonale wondgenezing kunnen de voorrandcellen hun actinekabels globaal coördineren waardoor een effect op macroscopisch niveau ontstaat. Bij volwassenen gaat dit gecoördineerde gedrag echter verloren, zodat het effect van actinekabels slechts lokaal kan optreden. Dit lijkt op σ in ons model, dat niet effectief is voor grote wonden. Beschouwing van de reeks vergelijkingen (2.2) en (2.3) in samenhang met de reeks randvoorwaarden (2.4), (2.5) en (2.6) toont aan dat chemotatisch-gedreven migratie inderdaad een vrij-grensprobleem is waarbij verschillende parameters betrokken zijn om de biologische complexiteit weer te geven en de studie van eenvoudige gevallen, bijvoorbeeld de cirkelvormige sluiting, kan helpen bij het begrijpen van hun overeenkomstige rol. Daarom presenteren wij eerst de analytische resultaten voor een gat dat te allen tijde cirkelvormig blijft, en vervolgens de stabiliteit ervan.

De resultaten

3.1. Regelmatige cirkelvormige sluiting

In de quasi-statische benadering kan vergelijking (2.2) analytisch worden opgelost en geeft

3.1

I0 (resp. K0) is de gemodificeerde Bessel-functie van de orde nul, regelmatig op r = 0 (resp. r → ∞). Vergelijking (3.1) houdt rekening met de continuïteit aan het grensvlak, waarbij A wordt gegeven door de fluxcontinuïteit, en luidt

3.2

met de volgende definitie voor(verhouding van twee opeenvolgende Bessel-functies) en het equivalent voorDe druk P0 binnen het epitheel wordt

3,3

We gebruiken de wet van Laplace om de onbekende vrijheidsgraad vast te leggen. De holomorfe functie ϕ, evenredig met log(r), vertegenwoordigt een mogelijke drijvende kracht die op het grensvlak verschijnt (d.w.z. de zogenaamde kenotaxis gedefinieerd in ). Inderdaad, zelfs in afwezigheid van morfogenen, wordt in vitro epitheelmigratie op vast substraat waargenomen, misschien ten gevolge van de reorganisatie van het cellulaire cytoskelet aan de wondrand. Merk op dat het model geldig blijft als we de chemotaxis buiten beschouwing laten, mits de definitie van lengte- en tijdseenheden wordt gewijzigd. Bovendien zijn C0 en P0 afhankelijk van de tijd via R(t). Voor de eenvoud laten we de tijdsafhankelijkheid vanDe snelheidvan de sluiting die uit vergelijking (3.5) wordt afgeleid, is dan

3.4

De sluitsnelheid is constant voor grote gaten en is exponentieel klein wanneer de straal R klein wordt, als men zich beperkt tot chemotische migratie en proliferatie. De straal van een groot gat begint dus met een lineaire afname in de tijd, maar de totale sluiting zal een oneindige tijd vergen om volledig tot stand te komen. Voor kleine gaten wordt chemotaxis subdominant in vergelijking met kenotaxis Ain op de interface die de sluitingsdynamiek controleert en de straal voldoet aan een diffusieve wet in t1/2 . Figuur 3 toont als functie van R voor verschillende waarden van α, δ en Ain/Λ en §4 bevat een bespreking van de parameters.

3.2. Verlies van circulariteit

Vergelijking (3.4) is echter alleen geldig als de cirkelvormige contour gehandhaafd blijft. Daarom voeren wij een lineaire stabiliteitsanalyse uit voor grote wonden (Ain ∼ 0) uitgaande van een kleine harmonische verstoring voor de straal als die variaties op de druk P en het concentratieveld C van dezelfde orde ε induceert als volgt:

3.5

waarbij het subscript i hetzij een grootheid ten opzichte van het gat (h, 0 < r < R) hetzij ten opzichte van de opperhuid (e, R < r < ∞) aangeeft. Hoewel alle perturbatieve grootheden afhangen van de gekozen toestand n, behandelt de lineaire verstoringsanalyse deze toestanden onafhankelijk. We laten dus de n-index weg en berekenen de perturbatieve concentratievelden ci(r) uit vergelijking (2.3)

3.6

terwijl het gestoorde drukveld wordt gegeven doorwaarbij we rekening houden met de harmonische modi van de holomorfe functie ϕ met B gefixeerd door de wet van LaplaceDoor de zwakte van ε kan ons stelsel vergelijkingen, eenmaal gelineariseerd, analytisch worden opgelost en de groeisnelheid van de modus n luidt

3.7

waar

Vergelijking (3.7) vertegenwoordigt een impliciete relatie voor Ωn, opgelost met iteratieve technieken en positieve waarden geven de toestanden aan die verantwoordelijk zijn voor de destabilisatie van de cirkelvormige grens naarmate de migratie voortschrijdt. De resultaten worden gepresenteerd voor verschillende waarden van Λ, α en δ, waarbij Ωn wordt weergegeven in figuur 4. Zie §4 voor de bespreking van de parameters. De resultaten wijzen op een instabiliteit die leidt tot een afwijking van een cirkel in korte tijd, voor n tot een kritische modus nc (gefixeerd door de capillariteit). Daarom zijn numerieke simulaties nodig om verder te gaan dan de lineaire analyse en de niet-lineariteiten volledig in aanmerking te nemen.

3.3. Volledige dynamica en numerieke methoden

We discriminereren c in vergelijking (2.2) en druk p in vergelijking (2.3) op een Cartesisch netwerk in de ruimte en impliciet in de tijd, met behulp van een niet-lineaire adaptieve Gauss-Seidel iteratieve methode . Aan de domeingrens leggen we zowel verdwijnende waarden van c als normale gradiënt van p op. Dan is de ruis wordt toegevoegd op C = c + χ met Beginnend met een perfecte cirkel met R = 90, wordt de wond sluiten gevolgd door de level-set methode ontwikkeld in waar een scalaire functie Φ met beschrijft de wond (Φ < 0), het epitheel (Φ > 0) en de interface (Φ = 0). De normaal en de kromming in vergelijking (2.5) worden berekend met standaard differentiaalmeetkunde: en Φ wordt bijgewerkt door de relatie , waarbij Vext is de constante uitbreiding van Vint op de interface van vergelijking (2.5) na de gradiënt Merk op dat deze methode simuleert een perfecte cirkelvormige sluiting zonder ruis. Volgens onze resultaten wijkt de wond al snel na de groei af van een perfecte cirkel, zoals te zien is in figuur 5 en 6 en in overeenstemming is met de stabiliteitsanalyse.

Discussie en conclusie

Er zijn verschillende onafhankelijke parameters in dit model. Sommige daarvan kunnen worden vastgesteld met de gepubliceerde experimentele gegevens (tabel 1). Onze snelheidseenheid is verenigbaar met de sluitsnelheid van het hoornvlies (3 dagen voor een gat met een straal van ongeveer 3 mm), hetgeen Λ ∼ 1 oplevert voor dit experiment volgens vergelijking (3.2). In figuur 4 variëren we de parameters α en δ, die moeilijker te schatten zijn, en ook Λ. Vanwege de grote omvang van de wonden in de praktijk geeft de lineaire stabiliteitsanalyse altijd een instabiliteit en deze conclusie is robuust voor parameterwijzigingen. Deze bevinding wordt bevestigd door volledig niet-lineaire simulaties in hetzelfde parametergebied (figuren 5 en 6). In de simulaties draagt een grote Λ (ca. 10, totale tijd ca. 60) bij tot een sneller sluiten in vergelijking met een kleine Λ (ca. 1, totale tijd ca. 600). Een typisch voorbeeld van het sluitingsproces met α = 1 en δ = 2 is te zien in figuur 5a. Het oprukkende grensvlak wordt golvend naarmate de wond geneest; wanneer de wond echter klein wordt, herstelt oppervlaktespanning de wond tot een aardappelvorm die in overeenstemming is met de lineaire stabiliteitsanalyse. Deze oppervlaktespanning kan de wond ook afknellen tot kleinere stukjes, zoals te zien is in figuur 5b(ii), figuur 6 en in . Deze gebeurtenis vereist eerst een meer onregelmatige afsluiting (rode pijlen in figuur 6), wanneer de concentratie van chemoattractant minder homogeen is bij onvoldoende transversale flux (α = 0,1). Het afknellen kan zowel in het tussen- als in het eindstadium van het sluiten plaatsvinden (gele pijlen), consistent met waarnemingen in het late stadium van wondgenezing op een monolaag van MDCK-cellen (figuur 6, rechts), wat hetzelfde gedrag suggereert bij complexere wondgenezingsprocessen.

In dit werk hebben we theoretisch aangetoond dat wond re-epithelialisatie een grensinstabiliteit geeft onder klinisch realistische parameters. Gedreven door chemotaxis, introduceert ons model geen andere celactiviteiten die de wond in het eindstadium sluiten. Wij vermoeden echter dat deze chemotactische instabiliteit aan de rand van de wond de kwaliteit van het uiteindelijke herstel kan beïnvloeden. Tijdens de embryonale wondgenezing, waarbij een perfecte reconstructie wordt waargenomen, wordt de wond gesloten door een ‘purse string’ die een coördinatie vertegenwoordigt van cellen aan de voorrand, gefaciliteerd door de actinekabel. Dit mechanisme gaat verloren in de volwassen huid, waar de wond wordt gesloten door het gekrioel van cellen (verschillende lagen) op het granulatieweefsel . Vergeleken met een statisch substraat in vitro, ondergaat het granulatieweefsel aan het einde van de re-epithelialisatie samentrekking door myofibroblasten . Dit heeft inderdaad tot doel de rand samen te brengen, wat lijkt op een ‘purse string’, maar de contractie door die cellen moet compatibel zijn met de synchrone materiaalopbouw, wat mechanisch en systematisch een uitdaging is.

Aan het eind bespreken we ons model in de context van de wondgenezing van de huid in vivo. Als de wond diep in de lederhuid doordringt, wat bij de meeste wonden het geval is, gedragen de twee lagen zich verschillend tijdens de re-epithelialisatie. De diepte van een wond draagt bij tot de dikte in de onderste laag waar de chemo-attractant vrijkomt. Rekening houdend met de re-epithelialisatie waarbij slechts enkele lagen cellen beweeglijk worden boven de onderste stapels waar de chemoattractant vrijkomt, draagt de diepte van de wond mathematisch bij tot de transversale chemoattractant fluxsterkte α. Naast α, waarbij de diepte van de wond een rol kan spelen, worden ook de geometrie, de grootte van de wond en de diffusiecoëfficiëntverhouding δ in aanmerking genomen. In vergelijking met experimenten in vivo kan het wondgenezingsproces bij de mens verschillen van dat bij experimentele muizen als gevolg van verschillende biomechanische eigenschappen van de huid. Indien men echter van plan is het probleem in vivo te beschouwen, rekening houdend met de bio-elasticiteit, komt de uitdaging niet alleen van de verschillende componenten van de twee lagen, maar ook van het feit dat de overgang tussen de huidlaag en de epidermale laag zeer ongeordend is, zelfs voor de intacte huid , zoals aangetoond in ons vorig werk. In de derde dimensie moet een regelmatig patroon worden gedefinieerd dat wij als “normaal” beschouwen. Aangezien het wondweefsel tijdens de genezing remodelleert, kunnen de mechanische parameters niet als constanten worden beschouwd en de relaxatie van het weefsel evolueert waarschijnlijk op een grotere tijdschaal dan de re-epithelialisatie. Met deze relaxatieprocessen moet dan ook rekening worden gehouden bij het voorspellen van de kwaliteit van de uiteindelijke herstelling. Daarvoor moet de onregelmatigheid van de wondrand, aangedreven door chemotaxis, als een ingrediënt worden beschouwd.

Funding statement

Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door AAP Physique Cancer 2012.

Footnotes