Reepitelización: avance de la frontera epitelial durante la cicatrización de heridas

Introducción

La piel de los adultos está formada por tres capas: la epidermis y la dermis separadas por la membrana basal. Cuando se produce una lesión profunda que destruye una parte de la dermis, ésta tiene que ser reparada rápidamente para restaurar la barrera protectora . La cicatrización de heridas in vivo es un complejo proceso de reparación orquestado por vías intra e intercelulares. Para recuperar la integridad de la piel, este proceso se lleva a cabo mediante cuatro etapas sucesivas pero superpuestas: coagulación, inflamación, reepitelización y remodelación. Inmediatamente después de una lesión, se forma un coágulo compuesto principalmente por fibras de fibrina y plaquetas para taponar la herida (etapa 1). Posteriormente, en los 2-10 días siguientes (fase 2), el coágulo es infiltrado continuamente por células inflamatorias que limpian los restos y liberan factores químicos, como el factor de crecimiento endotelial vascular y el factor de crecimiento transformante beta. Una vez establecido el gradiente químico, se reclutan diferentes células para fabricar el nuevo tejido (etapa 3). Por un lado, la neo-vasculatura y los fibroblastos (que depositan colágeno) son reclutados en la dermis, reformando el coágulo en un tejido de granulación, que apoya nutritiva y físicamente la reparación de las capas superiores. Por otro lado, los queratinocitos migran y proliferan en el borde de la herida para extender la alfombra epitelial recién formada, formada por varias capas de células en la epidermis. Este proceso se denomina reepitelización y dura de dos a tres semanas. Al final de la tercera fase, los miofibroblastos transformados a partir de los fibroblastos se contraen e intentan unir el borde de la herida. Desaparecen por apoptosis en la dermis. La remodelación (fase 4) continúa durante meses o incluso años para restablecer la homeostasis de la piel normal. Sin embargo, la estructura anatómica normal no se recupera realmente y se forma una cicatriz a partir del tejido de granulación. Mientras que esto es así en el caso de las heridas grandes de los humanos adultos, las de los embriones humanos pueden cerrarse perfectamente, sin que se conozcan del todo las razones. Curiosamente, se cree que la formación de la cicatriz es un sacrificio evolutivo para conseguir un cierre rápido de la herida, y así lo indica la intensa y redundante respuesta inflamatoria que media los comportamientos celulares sistemáticos durante la reepitelización mediante la liberación de señales químicas. En todos los casos, la cicatriz final es el resultado de la interacción entre las células y el microambiente a través de factores físicos y químicos durante las cuatro etapas.

Aquí nos centramos en la reepitelización cuando los queratinocitos, las células predominantes de la epidermis, se desprenden de la membrana basal, migran hacia el margen de la herida y proliferan, impulsados por los morfógenos del tejido de granulación . Varios grupos han realizado recientemente experimentos muy cuidadosos de migración de epitelio in vitro . Realizados sobre un sustrato sólido, implican el avance de una monocapa motivado por el comportamiento colectivo de las células mediante la migración, la generación de fuerzas y la reorganización del citoesqueleto celular en el margen. Los hallazgos indican una manera no intuitiva de las células para lograr la robustez durante la reparación, donde la quimiotaxis parece no ser decisiva para la migración celular global in vitro. Sin embargo, debido a las abundantes señales morfogénicas liberadas en la herida in vivo en comparación con los experimentos in vitro, la quimiotaxis domina el comportamiento colectivo de las células durante el proceso de cicatrización de la herida. Más cerca de la curación de heridas in vivo (figura 1a(i)(ii)), se ha reconstituido una córnea artificial (figura 1b(i)(ii)) mediante la introducción de células epiteliales, fibroblastos y factores de crecimiento en una placa de Petri tridimensional. Curiosamente, todos estos trabajos se refieren a la geometría circular y no al corte lineal realizado en experimentos anteriores. Aunque están bien controlados, no está claro que estos sistemas presenten toda la complejidad de la curación de heridas in vivo . No obstante, tanto los experimentos in vivo como in vitro presentan una evolución desordenada de los bordes, lo que indica una posible irregularidad universal debida a la quimiotaxis (figura 1).

En este trabajo, describimos la reepitelización considerando un agujero circular en un tejido, adaptando un modelo dinámico reciente de migración quimiotáctica impulsada por gradientes morfogenéticos. Al ser continuo, el modelo describe el tejido a una escala mayor que el tamaño celular pero menor que el tamaño del agujero. Aquí no distinguimos las especies celulares ni las categorías de quimioatrayentes. Este último es suministrado continuamente por un flujo entrante desde la tercera dimensión normal a la capa epitelial y captado por los receptores celulares. Como se muestra en , la delgadez de la capa móvil transforma el proceso tridimensional en un modelo bidimensional, en el que la variación de espesor localizada en el borde contribuye a una tensión T. Además, suponemos que existe una fuerte fricción viscosa entre la capa móvil y el sustrato , lo que permite escribir una ley de Darcy para el campo de velocidad media dentro del tejido, mientras que las interacciones célula-célula y la mitosis se transforman en condiciones de contorno de la interfaz en el límite de la interfaz aguda. En primer lugar, presentamos el modelo físico y, a continuación, el tratamiento analítico que da una solución explícita para la geometría circular y un estudio de su estabilidad. De hecho, en el caso de una frontera lineal, se ha demostrado que se produce una inestabilidad de gran longitud de onda a bajas velocidades debido a un modo de Goldstone (invariancia traslacional) que la tensión superficial por sí sola no puede conseguir prohibir . Intuitivamente, se puede esperar que desaparezca para agujeros pequeños al acentuarse el efecto de la tensión superficial. Por el contrario, al igual que en los experimentos in vitro, los agujeros más grandes pueden presentar inestabilidades de contorno que conducen a comportamientos dinámicos que pretendemos predecir. Para ir más allá del análisis de estabilidad, el problema de límites libres dependiente del tiempo requiere métodos numéricos capaces de resolver ecuaciones en dominios en evolución. Optamos por abordar nuestro problema mediante métodos de conjuntos de niveles, desarrollados por primera vez en la década de 1980 por Osher & Sethian , que son capaces de rastrear automáticamente las interfaces en movimiento y los cambios topológicos y se han aplicado con éxito a problemas, como las interacciones líquido-gas, el procesamiento de imágenes y el crecimiento de tumores. Debido a la naturaleza de nuestro problema teórico, seleccionamos la metodología desarrollada para el crecimiento tumoral. A continuación, presentamos primero el modelo, introduciendo los parámetros físicos más relevantes, luego el análisis para la inestabilidad de amplitud débil, y finalmente los métodos numéricos y las simulaciones para el estado final del cierre.

El modelo

Consideramos un agujero circular Ω en una población celular bidimensional de densidad ρ inmersa en un entorno morfogenético (figura 2). Las células migran hacia arriba del gradiente de morfógenos, siendo el flujo quimiotáctico proporcional al gradiente de concentración de morfógenos , siendo Λc una constante de movilidad. La repartición de morfógenos dentro y fuera del agujero Ω se alimenta a través de fuentes provenientes de abajo. La mitosis ocurre sólo en el borde y el cierre se logra principalmente por la migración. El balance de masas para la población celular es entonces

2,1

Sin tener en cuenta el crecimiento volumétrico (γ = 0) en el tejido excepto en la periferia, la densidad celular es constante y ρ = ρ0. La ecuación (2.1) se simplifica en y da que la velocidad normal del frente es directamente proporcional al gradiente de concentración normal. A velocidades extremadamente bajas, la migración celular satisface una ley de Darcy , siendo Mp un coeficiente de porosidad igual al cuadrado de la altura del epitelio dividido por un coeficiente de fricción. Como se muestra en , esta ley se deduce en los tejidos cuando la fricción entre fases o la fricción con un sustrato equilibra la parte hidrostática de la tensión elástica que actúa sobre las células . La herida perturba el estado homeostático del entorno y una fuente de morfógenos intentará restablecer un valor de equilibrio óptimo en la apertura c0. Tomando esta concentración como unidad para la concentración de morfógenos (dando ), τc el tiempo de captación como unidades de tiempo, Le como unidad de longitud (con , siendo De el coeficiente de difusión en el interior del epitelio), obtenemos

2,2

con el índice h o e referido al dominio interior (agujero) o exterior (epitelio). δ = Dh/De representa la relación entre el coeficiente de difusión en el agujero Dh y el tejido De, es mayor que 1, y α da la fuerza del flujo transversal que mantiene el nivel de morfógeno dentro del agujero. Debido a la relativa lentitud de la migración celular, despreciamos la dependencia del tiempo en la ecuación (2.2). Tomando De/Mp como unidad de presión simplificamos la ley de Darcy en

, donde por simplicidad mantenemos la misma notación para p y v. A partir de la ecuación de balance de masas (2.1), obtenemos la siguiente ecuación de Laplace que acopla la presión desconocida p a la concentración de quimioatrayente c:

2.3

Así, obtenemos, donde ϕ es una función holomorfa que satisface Δϕ = 0. Finalmente, debemos prestar especial atención a las condiciones de contorno de la interfaz. Para la ecuación (2.2), se refieren a la continuidad de la concentración y a la discontinuidad del flujo debido al consumo de morfógenos por la mitosis en la frontera(para la demostración, véase ):

2,4

donde N es la normal exterior. Γ2 es la tasa de captación constreñida en la frontera que se discute a continuación junto con las tasas de mitosis Γ1 yen la frontera. La capilaridad fija el salto de presión en la interfaz

2,5

que da la condición de frontera libre considerando el efecto geométrico dondees el radio de curvatura local.es igual al radio si la geometría es un círculo. Sin embargo, considera el efecto local a pequeña escala de longitud cuando el límite es perturbado. Al mismo tiempo, la velocidadde la interfase difiere de la del epitelio v por la proliferación celular en la frontera y obtenemos

2.6

donde Γ1 es la tasa de mitosis y σ el número capilar relacionado con la tensión T en la interfase por lo queLa cicatrización de la herida in vivo está dominada por la migración bidimensional y los morfógenos no son probablemente los nutrientes, por lo que Γ2 se desvanece y Γ1c debe ser sustituido porsi también consideramos la mitosis sin el efecto cuantitativo de las concentraciones de nutrientes. El número de capilares σ puede implicar las actividades del cable de actina (microfilamentos agrupados) en las células. Durante la cicatrización de la herida embrionaria, las células del borde anterior pueden coordinar sus cables de actina de forma global, lo que genera un efecto a nivel macroscópico. Sin embargo, este comportamiento coordinado se pierde en los adultos, por lo que el efecto de los cables de actina puede actuar sólo localmente. Esto se asemeja a σ en nuestro modelo, que no es eficaz para las heridas grandes. La consideración del conjunto de ecuaciones (2.2) y (2.3) junto con el conjunto de condiciones de contorno (2.4), (2.5) y (2.6) muestra que la migración impulsada por la quimiotaxis es, en efecto, un problema de contorno libre en el que intervienen varios parámetros para representar la complejidad biológica y el estudio de casos sencillos, por ejemplo el cierre circular, puede ayudar a comprender sus correspondientes funciones. Así, presentamos primero los resultados analíticos para un agujero que permanece circular en todo momento, y luego su estabilidad.

Los resultados

3.1. Cierre circular regular

En la aproximación cuasiestática, la ecuación (2.2) puede resolverse analíticamente y da

3.1

I0 (resp. K0) siendo la función de Bessel modificada de orden cero, regular en r = 0 (resp. r → ∞). La ecuación (3.1) tiene en cuenta la continuidad en la interfase, siendo A dada por la continuidad de flujo y se lee

3.2

con la siguiente definición para(relación de dos funciones de Bessel sucesivas) y el equivalente paraLa presión P0 en el interior del epitelio se convierte en

3,3

Utilizamos la ley de Laplace para fijar el grado de libertad desconocido. La función holomorfa ϕ, proporcional a log(r), representa una posible fuerza motriz que aparece en la interfaz (es decir, la llamada kenotaxis definida en ). En efecto, incluso en ausencia de morfógenos, se observa in vitro la migración del epitelio sobre el sustrato sólido, quizá debido a la reorganización del citoesqueleto celular en el margen de la herida. Obsérvese que el modelo sigue siendo válido si descartamos la quimiotaxis siempre que se modifique la definición de las unidades de longitud y tiempo. Además, C0 y P0 dependen del tiempo a través de R(t). Para simplificar, descartamos la dependencia temporal deLa velocidaddel cierre deducida de la ecuación (3.5) es entonces

3.4

La velocidad de cierre es constante para agujeros grandes y es exponencialmente pequeña cuando el radio R se hace diminuto, si se restringe la migración y la proliferación quimiotáctica. Así, el radio de un agujero grande comienza con una disminución lineal en el tiempo, pero el cierre total tomará un tiempo infinito para un logro completo. Para agujeros pequeños, la quimiotaxis se vuelve subdominante en comparación con la kenotaxis Ain en la interfaz que controla la dinámica de cierre y el radio satisface una ley difusiva en t1/2 . La figura 3 muestra en función de R para diferentes valores de α, δ y Ain/Λ y §4 contiene una discusión de los parámetros.

3.2. Pérdida de circularidad

Sin embargo, la ecuación (3.4) sólo es válida si se mantiene el contorno circular. Es por ello que realizamos un análisis de estabilidad lineal para heridas grandes (Ain ∼ 0) suponiendo una pequeña perturbación armónica para el radio como induciendo variaciones sobre la presión P y el campo de concentración C del mismo orden ε como sigue:

3.5

donde el subíndice i indica una cantidad relativa al agujero (h, 0 < r < R) o a la epidermis (e, R < r < ∞). Aunque todas las cantidades perturbadoras dependen del modo n seleccionado, el análisis de perturbación lineal trata estos modos de forma independiente. Así que dejamos de lado el índice n y calculamos los campos de concentración perturbativos ci(r) a partir de la ecuación (2.3)

3.6

mientras que el campo de presión perturbado viene dado pordonde tenemos en cuenta los modos armónicos de la función holomorfa ϕ con B fijado por la ley de LaplaceDebido a la debilidad de ε, nuestro sistema de ecuaciones, una vez linealizado, puede resolverse analíticamente y la tasa de crecimiento del modo n se lee

3.7

donde

La ecuación (3.7) representa una relación implícita para Ωn, resuelta mediante técnicas iterativas y los valores positivos indican los modos responsables de la desestabilización de la frontera circular a medida que avanza la migración. Los resultados se presentan para diferentes valores de Λ, α y δ, donde Ωn se muestra en la figura 4. Véase §4 para la discusión de los parámetros. Los resultados indican una inestabilidad que conduce a una desviación del círculo en poco tiempo, para n hasta un modo crítico nc (fijado por la capilaridad). Es por ello que las simulaciones numéricas son necesarias para ir más allá del análisis lineal y considerar plenamente las no linealidades.

3.3. Dinámica completa y métodos numéricos

Discretizamos c en la ecuación (2.2) y la presión p en la ecuación (2.3) en una malla cartesiana en el espacio e implícitamente en el tiempo, utilizando un método iterativo no lineal adaptativo de Gauss-Seidel . En la frontera del dominio, imponemos los valores de desaparición de c y el gradiente normal de p. A continuación, se añade el ruido en C = c + χ con Comenzando con un círculo perfecto con R = 90, el cierre de la herida es seguido por el método de conjunto de niveles desarrollado en donde una función escalar Φ con describe la herida (Φ < 0), el epitelio (Φ > 0) y la interfaz (Φ = 0). La normal y la curvatura en la ecuación (2.5) se calculan mediante geometría diferencial estándar: y Φ se actualiza mediante la relación , donde Vext es la extensión constante de Vint en la interfaz a partir de la ecuación (2.5) siguiendo el gradiente Nótese que este método simula un cierre circular perfecto sin ruido. Según nuestros resultados, la herida se desvía de un círculo perfecto poco después del crecimiento, como se muestra en las figuras 5 y 6 y de acuerdo con el análisis de estabilidad.

Discusión y conclusión

Hay varios parámetros independientes en este modelo. Podemos fijar algunos de ellos con los datos experimentales publicados (tabla 1). Nuestra unidad de velocidad es compatible con la velocidad de cierre de la córnea (3 días para un orificio de radio de aproximadamente 3 mm ) dando Λ ∼ 1 para este experimento según la ecuación (3.2). En la figura 4, variamos los parámetros α y δ, que son más difíciles de estimar, y también Λ. Debido al gran tamaño de las heridas en la práctica, el análisis de estabilidad lineal da siempre una inestabilidad y esta conclusión es robusta a los cambios de parámetros. Esta conclusión se confirma con simulaciones totalmente no lineales bajo el mismo rango de parámetros (figuras 5 y 6). En las simulaciones, un Λ grande (aprox. 10, tiempo total aprox. 60) contribuye a un cierre más rápido en comparación con un Λ pequeño (aprox. 1, tiempo total aprox. 600). Un ejemplo típico del proceso de cierre con α = 1 y δ = 2 se muestra en la figura 5a. La interfaz de avance se vuelve ondulada a medida que la herida se cura; sin embargo, cuando la herida se hace pequeña, la tensión superficial vuelve a estabilizar la herida a una forma de patata consistente con el análisis de estabilidad lineal. Esta tensión superficial también puede pellizcar las heridas en trozos más pequeños, como se muestra en la figura 5b(ii), en la figura 6 y en . Este evento requiere al principio un cierre más irregular (flechas rojas en la figura 6), cuando la concentración de quimioatrayente es menos homogénea dado el flujo transversal inadecuado (α = 0,1). El pinchazo puede producirse tanto en la fase intermedia como en la final del cierre (flechas amarillas), lo que concuerda con las observaciones realizadas en la fase tardía de la cicatrización de la herida en una monocapa de células MDCK (figura 6, derecha), lo que sugiere el mismo comportamiento en procesos más complejos de cicatrización de la herida.

En este trabajo, hemos demostrado teóricamente que la reepitelización de la herida da una inestabilidad del borde bajo parámetros clínicamente realistas. Impulsado por la quimiotaxis, nuestro modelo no introduce otras actividades celulares que cierren la herida en la fase final. Sin embargo, conjeturamos que esta inestabilidad quimiotáctica en el borde de la herida puede afectar a la calidad de la reparación final. Durante la cicatrización de la herida embrionaria, en la que se observa una reconstrucción perfecta, la herida se cierra mediante un «cordón» que representa una coordinación de las células del borde delantero facilitada por el cable de actina . Este mecanismo se pierde en la piel adulta, donde la herida se cierra por el arrastre de las células (varias capas) sobre el tejido de granulación . En comparación con un sustrato estático in vitro, el tejido de granulación sufre una contracción al final de la reepitelización por parte de los miofibroblastos . De hecho, este propósito es juntar el borde que se asemeja a la «cuerda de la bolsa», pero la contracción por esas células necesita ser compatible con la constitución del material sincrónico, que es mecánica y sistemáticamente un desafío .

Al final, discutimos nuestro modelo en el contexto de la curación de la herida de la piel in vivo. A medida que la herida se adentra en la dermis, como es el caso de la mayoría de las heridas, las dos capas se comportan de forma diferente durante la reepitelización. La profundidad de una herida contribuye al grosor en la capa inferior donde se libera el quimioatrayente. Considerando la reepitelización en la que sólo varias capas de células se vuelven móviles por encima de las pilas inferiores donde se libera el quimioatrayente, la profundidad de la herida contribuye matemáticamente a la fuerza de flujo transversal del quimioatrayente α. Además de α, que puede implicar la profundidad de la herida, se consideran la geometría, el tamaño de la herida así como la relación del coeficiente de difusión δ. En comparación con los experimentos in vivo, el proceso de cicatrización de las heridas en humanos puede ser diferente al de los ratones de experimentación debido a las diferentes propiedades biomecánicas de la piel. Sin embargo, si se pretende considerar el problema in vivo teniendo en cuenta la bioelasticidad, el reto no sólo proviene de los diferentes componentes de las dos capas, sino también del hecho de que la unión entre la capa dérmica y la epidérmica es muy desordenada incluso para la piel intacta , como se ha demostrado en nuestro trabajo anterior. Se debe definir un patrón regular en la tercera dimensión que consideramos «normal». Además, como el tejido de la herida se remodela durante la cicatrización, los parámetros mecánicos no pueden considerarse constantes y la relajación del tejido probablemente evoluciona en una escala de tiempo mayor que la reepitelización. De hecho, estos procesos de relajación deberían considerarse también para predecir la calidad de la reparación final. Antes de eso, la irregularidad del borde de la herida impulsada por la quimiotaxis debería considerarse como un ingrediente.

Declaración de financiación

Este trabajo fue apoyado en parte por AAP Physique Cancer 2012.

Notas